Untersuchungen zur Rolle des Muskel-LIM-Proteins (MLP) bei der Entstehung von Kardiomyopathien

Abstract

Unter Kardiomyopathien werden sämtliche Erkrankungen des Herzens, der Blutgefäße und des Blutkreislaufsystems zusammengefasst, wobei zwischen angeborenen und erworbenen unterschieden wird. Die hypertrophe (HCM) und die dilatative Kardiomyopathie (DCM) zählen zu den verbreitetsten Herzerkrankungen und gehen mit einer mechanischen bzw. elektrischen, kardialen Dysfunktion einher. In bis zu 50 % der Fälle wird dabei eine familiäre Häufung beobachtet. Die Identifikation und Charakterisierung damit assoziierter Gene und molekularer Signalwege sind Grundlage für die Entwicklung spezifischer Therapiekonzepte. Es wird angenommen, dass G-Protein-gekoppelte Signalwege an der Entstehung und Manifestierung pathologischer Erscheinungsbilder des Herzens beteiligt sind. Im Mausmodell konnten Untersuchungen von Herzen bzw. Herzmuskelzellen (Kardiomyozyten) mit Gαq bzw. Gα11 knockout in vivo sowie in vitro (z.B. über Echokardiographie, Histologie, Fluorometrie oder Elektrophysiologie) eine Reihe neuer Erkenntnisse erzielen, welche den Ausgangspunkt für eine Transkriptomanalyse isolierter Kardiomyozyten mittels "deep sequencing" bildeten. Hierbei wurde das Expressionsmuster zwischen Wildtyp (WT) und dKO verglichen, um Gene zu identifizieren welche mit der kardialen Insuffizienz in Zusammenhang mit Gαq/Gα11 assoziiert sind. Aus insgesamt 25000 identifizierten Genen konnten 3100 mit verändertem Expressionsniveau identifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit sollten diese Gene, besonders im Hinblick auf relevante, kardiale Signalwege klassifiziert, mittels quantitativer Realtime PCR (qPCR) verifiziert und genauer analysiert werden. Insbesondere der CMC („cardiac muscle contraction“) Signalweg zeigte hierbei deutliche Unterschiede, insbesondere in der Expression des CSRP3-Gens, welches für das „muscle LIM protein“ (MLP) kodiert und auf welches in dieser Arbeit ein besonderer Fokus gelegt wurde, da es ein potentielles Schlüsselgen im Kontext der molekularen Mechanismen bei der Entstehung von Kardiomyopathien darstellen könnte. MLP gehört zu den Cysteinreichen LIM-Domänen Proteine (CRPs) und wird im Herzen sowie in der quergestreiften Skelettmuskulatur exprimiert, wo es u.a. an der sogenannten Z-Scheibe des Sarkomers lokalisiert ist. Diese spielt eine besondere Rolle im Herzmuskel, da Dysfunktionen damit assoziierter Proteine u.a. zu Störungen der kardialen Mechano-sensation und Signaltransduktion, der mechanischen Kraftweiterleitung sowie der mitochondrialen Energiegewinnung führen. In den vergangenen Jahren konnten auch eine Reihe von Mutationen von MLP als Ursache für Kardiomyophatien identifiziert werden. Analysen eines MLP-KO Mausmodells zeigen beim homozygotem KO, dass etwa 70 % der Tiere im Alter von fünf bis zehn Tagen diastolische Dysfunktionen aufweisen und dass diese durchschnittlich 24 h später sterben (früher Phänotyp). Die überlebenden Mäuse entwickeln zwei bis vier Wochen nach ihrer Geburt eine dilatative Kardiomyopathie mit Hypertrophie und Herzinsuffizienz (adulter Phänotyp). Vergleicht man das Herzgewebe dieser Tiere mit WT-Herzen, ist dieses im MLP-KO insgesamt weicher und zeigt eine stark verminderte Muskelspannung. Die Glanzstreifen und Z-Scheiben erscheinen desorganisiert und verbreitert. Ähnliche Strukturveränderung findet man auch bei humaner Herzinsuffizienz. Neuste Erkenntnisse im Menschen zeigen, dass Veränderungen der MLP-Expression zur Entstehung von chronischen Herz-erkrankungen beitragen. Interessanterweise wurden sowohl bei Patienten mit DCM als auch HCM MLP-Mutationen gefunden, wobei diese vermutlich über Defekte in der kardialen Mechanosensation mit diesem Krankheitsbild assoziiert sind. Durch ein Screening von humanen DCM-, ICM-, HCM- Herzohr-Proben auf mRNA-Ebene konnten in dieser Arbeit neue Splice-Varianten des CSRP3-Gens gefunden werden. Diese resultieren in trunkierten Protein-Sequenzen, denen LIM-Domänen (Interaktion) fehlen. Des weiteren ist die NLS (Nukleäres Lokalisationssignal) betroffen, was potentiell einen Transport in den Zellkern reduziert. Zudem korreliert die Menge an CSRP3 mRNA mit dem Alter bzw. dem Grad der Erkrankung von Patienten und kann binnen sehr kurzer Zeiträume an die Umgebungsbedingungen adaptieren. Mittels adenoviraler Konstrukte wurden C-terminal mit tagRFPT fusionierte MLP-Isoformen (MLP-Volllänge und ohne Exon 3) in Kardiomyozyten eingeschleust, um deren Lokalisation sowie Einfluss auf die Zellphysiologie in adulten Ratten-Kardiomyozyten sowie humanen iPS-Zellen (zu Kardiomyozyten differenziert) zu untersuchen. Bereits die Überexpression von MLP resultiert in einer relativen Reduktion des Proteins am Sarkomer, während es weiterhin stabil an der Zellperipherie lokalisiert ist. Die Variante ohne Exon 3, und damit ohne LIM-Domäne 2, zeigt eine starke Misslokalisation sowie eine Desorganisation des Sarkomers. Beide MLPVarianten scheinen hingegen einen vergleichbaren Einfluss auf die Calcium-Homöostase zu haben, welcher sich in einer erhöhten intrazellulären Calcium-Konzentration, einem erhöhtem Transienten und einem verminderten "Post-Rest"-Verhalten niederschlägt. Zusammengefasst hat sowohl die Menge als auch die Art der Isoform (Splice-Form) von MLP einen großen Einfluss auf kardiale, hypertrophe Signalwege, was die postulierte Schlüsselrolle dieses Proteins für die kardiale Physiologie und Pathophysiologie unterstreicht.

Cardiomyopathies comprise all diseases of the heart, blood vessels and blood circulatory system. They can be differentiated between congenital and acquired heart diseases. Hypertrophic (HCM) and dilatative cardiomyopathies (DCM) are among the most common hereditary diseases associated with mechanical and/or electrical cardiac dysfunction. Up to 50 % of the incidents show a familial background. The elucidation of responsible genes and molecular signalling pathways can help driving the development of specific therapeutic concepts. It is assumed that the G protein-coupled signalling pathways are involved in the development and manifestation of pathological responses in the heart, such as cardiomypathies. Investigations of Gαq and Gα11 knock out mice or isolated cardiac muscle cells by using in vivo and in vitro methods (i.e. echocardiography, histology, fluorometry and electrophysiology) led to new, unexpected results. Based on this outcome, the expression patterns of wildtype (WT) and double knockout (dKO) cardiomyocytes were compared by transcriptome analysis of isolated cardiac myocytes, employing so-called "deep sequencing" in order to understand the genetic basis of the identified phenotypes. Among 25000 genes 3100 genes with significant differences in the expression levels between WT and dKO were identified, whereas genes of relevant cardiac signalling pathways should be verified and further investigated by using quantitative real-time PCR (qPCR). The analysis of the CMC (cardiac muscle contraction) signalling pathway revealed marked differences in the expression of the CSRP3 gene coding for the muscle LIM protein (MLP), to which a special focus was drawn in context of this work. MLP belongs to the family of cysteine-rich LIM domain proteins (CRPs) and is expressed exclusively in the heart as well as in striated skeletal muscle cells, were it is located at the so-called Z-disc, which seams to play an important role, because dysfunction of this structure leads to defects, for example in cardiac mechanosensitivity and signal transduction, mechanical force transmission and mitochondrial energy production. A number of mutations of MLP have been identified as a cause of cardiomyopathies recently. Analysis of an established MLP-KO mouse model provides possible insights in MLP-associated mechanisms that can lead to cardiomyopathies. In homozygous MLP-KO mice, approximately 70 % of the animals aged five to ten days show signs of fatigue and die an average 24 hours later (early phenotype). The remaining MLP-KO mice develop a DCM with hypertrophy and cardiac insufficiency (adult phenotype) two to four weeks after birth. Comparing the heart tissue of such mutants with the wild type, it is softer in the MLP-KO and shows a strongly reduced muscle tension. In the MLP-KO mouse, the interclated disc and Z-discs appear disorganized and are arranged wider. Similar structural changes are also found in human heart failure. In humans, recent findings show that changes in MLP expression are involved in the development of chronic heart disease. Interestingly, MLP mutations have been found in both DCM and HCM patients and are likely to lead to defects in cardiac mechanosensitivity in these diseases. A screening of human DCM, ICM and control samples at the mRNA level revealed new splice variants resulting in a truncated amino acid sequence, which is missing LIM domains, leading to an impaired interaction capability, and the NLS (nuclear localization signal), which potentially impairs transport into the cell nucleus. In addition, the amount of CSRP3 mRNA correlates with the age or degree of disease of patients and can adapt to the environmental conditions within a very short period of time. Using adenoviral constructs, MLP isoforms (MLP full-length and without exon 3) tagged with tagRFPT were introduced into cardiomyocytes in order to investigate their localization and influence on cell physiology in adult rat cardiomyocytes and human IPS cells (differentiated to cardiomyocytes). Already the overexpression of MLP has an influence on the localization of MLP at the sarcomere while it is still stably located at the cell periphery. The variant without exon 3, and thus without LIM domain 2, shows a strong mislocalization and a disorganization of the sarcomere. However, both MLP variants seem to have a comparable influence on calcium homeostasis, resulting in an increased intracellular calcium level, increased transients and reduced post-rest behaviour. In summary, both the amount and the degree of splicing of MLP have a major impact on cardiac, hypertrophic signalling pathways, underscoring the postulated key role of this protein in cardiac physiology and pathophysiology.