Einfluss der Experimentellen Autoimmunen Encephalomyelitis auf elektrische und chemische Synapsen der murinen Retina

Abstract

Die Multiple Sklerose gehört zu den chronisch-degenerativen Erkrankungen des ZNS. Im Rahmen der neuropathologischen Krankheitsprozesse kommt es durch das patienteneigene Immunsystem zur zentralen Inflammation und Autoantikörperbildung. Folge ist eine fokale Degeneration der neuronalen Myelinscheiden an multiplen Stellen im ZNS (REALE, SANCHEZ-RAMON, 2017). In der Pathogenese der MS spielen intra- und interzelluläre Kanalproteine (Panx1 und verschiedene Connexin-Subtypen) eine bedeutende Rolle. Sie sind beispielsweise bei der Aktivierung zytotoxischer autoreaktiver T-Lymphozyten, bei der Vermittlung der Entzündungsreaktion an den Myelinscheiden und bei einer Fortleitung pro- inflammatorischer Botenstoffe in weitere Zellen beteiligt (ADAMSON, LEITINGER, 2014; MAIER et al., 2004; RIPPS, 2002; THOMPSON, 2015; WONG et al., 2014). Rund ein Drittel der Patienten mit MS entwickelt als Frühsymptom eine Neuritis des Nervus opticus, verschiedenartige Sehstörungen bis hin zum völligen Ausfall des Gesichtsfeldes unter Beteiligung der Retina (HEROLD et al., 2015; LARABEE et al., 2016; SYC et al., 2012). Die genauen Pathomechanismen dieser Mitbeteiligung des visuellen Systems sowie das Ausmaß der retinalen Läsion bei der MS sind aktuell jedoch noch nicht im Detail bekannt. Es wurde daher in dieser Arbeit in der ersten Hypothese postuliert, dass die durch die zentrale Inflammation induzierte axonale Schädigung im N. opticus die Apoptose retinaler Ganglienzellen zur Folge hat sowie sich eine Reduktion synaptischer Verbindungen innerhalb der Retina zeigt. Experimentell wurde in dieser Arbeit mit dem Tiermodell der Experimentellen Autoimmunen Encephalomyelitis (EAE) gearbeitet. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein möglicher neuroprotektiver Effekt des Pannexin1 Inhibitors Probenecid (PBN) auf die retinalen Neurone der Versuchstiere untersucht. Hypothese des zweiten Teils war, dass eine PBN-Intervention mit 100mg/kg Körpergewicht ab Tag eins nach EAE-Induktion eine Prävention der neuronalen Schädigung im Auge zur Folge hat. Es wurde angenommen, dass retinale Strukturproteine von elektrischen und chemischen Synapsen in der präventiv mit PBN behandelten Gruppe im Vergleich zur EAE- Gruppe in höherer Dichte immunologisch nachweisbar sein würden und weniger Zellen in eine EAE-induzierte Apoptose eintreten. In beiden Teilen dieser Arbeit wurde die Zahl der Ganglienzellen über den Nachweis des Ganglienzell-spezifischen Proteins RBPMS sowie der programmierte Zelltod über das Apoptose-assoziierte Protein Cleaved-Caspase-3 bestimmt. Connexin 36, das Gap junction Protein elektrischer Synapsen der Retina, sowie RIBEYE, exprimiert in den chemischen Ribbon-Synapsen der Retina, wurden analysiert, um die synaptische Verschaltung in der Retina bei EAE und unter Therapie zu untersuchen. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Induktion der EAE im Tiermodell sowohl zu klinisch messbaren Paralysen der Versuchstiere führte als auch degenerative I Veränderungen mit signifikant verringerter Expression der untersuchten Proteine an neuronalen Zellen verschiedener Schichten der Retina stattfanden. Im zweiten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich klinisch die Motorik der Versuchstiere signifikant unter präventiver PBN-Gabe verbesserte. Zudem traten unter Therapie mit PBN signifikant weniger Ganglienzellen in die Apoptose ein. Trotz PBN-Gabe kam es jedoch zum Verlust synaptischer Proteine im Vergleich zur Kontrollgruppe. Zusammengenommen legen die Ergebnisse dieser Arbeit nahe, dass nicht nur der optische Nerv und die Ganglienzellen im Rahmen des Krankheitsgeschehens der MS degenerieren, sondern auch synaptische Bestandteile weiterer retinaler Schichten geschädigt werden. Zudem konnte gezeigt werden, dass präventiv verabreichtes PBN einen protektiven Effekt auf die Versuchstiere mit einem besseren motorischen Ergebnis unter EAE und einem geringeren Ganglienzellschaden im Vergleich zur nicht behandelten Gruppe hat, es aber dennoch zur verringerten Expression synaptischer Proteine kommt.

Summary Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS). In the process of the neuropathological genesis of this disease, the patient’s own immune system initiates a central inflammation and generates autoantibodies, causing focal degeneration of neuronal myelin sheaths in multiple areas within the CNS (REALE, SANCHEZ-RAMON, 2017). The pathogenesis of MS is based mainly on intra- and intercellular protein channels (Panx1 and multiple subtypes of connexin-channels). These channels e.g. play an important role in the activation of cytotoxic T-lymphocytes, in passing of inflammatory reactions at the myeline sheath and for the transport of pro-inflammatory substances to bystanding cells (ADAMSON, LEITINGER, 2014; MAIER et al., 2004; RIPPS, 2002; THOMPSON, 2015; WONG et al., 2014). Approximately one third of MS-patients develop as initial symptom a neuromyelitis optica, i.e. a wide range of visual disorders up to a complete failure of the visual perceptive field including damage of the retina (HEROLD et al., 2015; LARABEE et al., 2016; SYC et al., 2012). It is still not certain how those pathomechanisms involving the visual system precisely work and the extent of retinal lesions are currently still unknown. Therefore, the first hypothesis of this thesis postulates that axonal damage of the optical nerve, caused by central inflammation, results in an apoptosis of retinal ganglion cells as well as in a reduction of retinal synaptic structures of multiple retinal layers. The research work for this thesis is based on the animal experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model. The second part of this thesis deals with research examining a potential neuro-protective effect of Panx1 inhibitor PBN on retinal neurons of laboratory mice. This part is based on a hypothesis saying that a PBN intervention of 100mg/kg body weight injected at day one after an EAE induction can prevent neuronal damage in the animal`s eye. It was assumed that an immunological staining would prove a higher density of structural retinal molecules of electrical and chemical synapses within a preventively treated PBN group, when compared with EAE-groups, and that a smaller number of cells would enter an EAE-induced apoptosis. In both parts of this thesis retinal ganglion cells were counted using the ganglion cell specific protein RBPMS. Apoptosis was analyzed using the apoptosis associated protein cleaved caspase-3. In order to examine retinal synaptic connections under EAE and under preventive treatment, connexin 36, the gap junction protein of retinal electric synapses, as well as RIBEYE, expressed in retinal chemical ribbon synapses, were analyzed. In the first part of this thesis it could be demonstrated that an induction of EAE in an animal model leads to detectable paralyses of the animals as well as to degenerations with a significantly decreased expression of analyzed proteins in multiple layers of the retina. The second part of this thesis could prove that motoric results of animals preventively treated with III PBN increased significantly. Furthermore, under PBN-treatment a significant number of retinal ganglion cells were prevented from entering apoptosis. But yet, despite PBN treatment, synaptic proteins decreased in expression in comparison with the control group. To sum up the results of this thesis, it may be presumed that during the pathogenesis of MS, lesions are not limited to the optic nerve and the retinal ganglion cells but degeneration also takes place in multiple retinal synaptic components. Additionally, it could be demonstrated that preventively applicated PBN has a neuro-protective effect on laboratory mice with a better motoric outcome under EAE induction, in comparison with groups without treatment. But still, depletion of expressed retinal synaptic proteins could not be prevented by this treatment.