Isolierte mikrovaskuläre Fragmente aus Fettgewebe als Vaskularisierungseinheiten im Tissue Engineering: Etablierung neuer Strategien zur Verbesserung ihrer Nutzbarkeit und ihres Vaskularisierungspotentials

Abstract

Das Ziel des Tissue Engineerings ist die Herstellung von autologem Ersatzgewebe. Hierzu werden Zellen auf Trägermatrizes, die man als Scaffolds bezeichnet, gesiedelt. Die so entstandenen Gewebekonstrukte können anschließend in einen Gewebedefekt implantiert werden. Für den klinischen Erfolg dieser Methode ist die rasche Vaskularisierung der Implantate entscheidend. Dieser Prozess kann durch die Prävaskularisierung von Scaffolds mit adipösen mikrovaskulären Fragmenten, die sich über Inoskulation mit den Gefäßen des umliegenden Empfängergewebes verbinden, erheblich beschleunigt und verbessert werden. Die Ergebnisse vorangehender Studien weisen auf eine deutlich eingeschränkte Vaskularisierungskapazität von mikrovaskulären Fragmenten aus alten Spendern hin. Im ersten Studienabschnitt der vorliegenden Arbeit wurde daher zur möglichen Lösung dieses Problems erstmalig das Biobanking von mikrovaskulären Fragmenten junger Spender etabliert. Hierzu wurden mikrovaskuläre Fragmente aus den epididymalen Fettpolstern von C57BL/6 Spendermäusen isoliert, bei -196 °C für 7 Tage kryokonserviert und morphologisch sowie funktionell mit frisch isolierten Fragmenten verglichen. Zusätzlich wurden zur Analyse der in vivo Vaskularisierungskapazität kryokonservierte sowie frisch isolierte mikrovaskuläre Fragmente aus transgenen C57BL/6-TgN(ACTB-EGFP)1Osb/J Spendermäusen auf Integra®-Scaffolds gesiedelt und in die Rückenhautkammern von Green Fluorescent Protein (GFP)-negativen C57BL/6 Wildtyp-Empfängermäusen implantiert. Die Entwicklung neuer Gefäßnetzwerke wurde mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie, Histologie und Immunhistochemie über 14 Tage untersucht. Rasterelektronenmikroskopische und durchflusszytometrische Analysen zeigten eine unveränderte Morphologie und zelluläre Zusammensetzung der kryokonservierten Fragmente, während ihre Anzahl und Viabilität im Vergleich zu frisch isolierten Kontrollen reduziert war. Die Kryokonservierung steigerte weiterhin die Expression pro-angiogener Proteine innerhalb der Fragmente, so dass sie auch mehr Wachstumsfaktoren sezernierten. Entsprechend verbanden sich sowohl die kryokonservierten als auch die frisch isolierten mikrovaskulären Fragmente innerhalb der implantierten Integra®-Scaffolds rasch zu durchbluteten Gefäßnetzwerken, welche sich in ihrer Dichte und mikrohämodynamischen Parametern nicht unterschieden. Dabei konnte die gesteigerte angiogene Aktivität der kryokonservierten Fragmente immunhistochemisch anhand eines größeren Anteils GFP-positiver Gefäße innerhalb der Netzwerke gezeigt werden. Es kann daher geschlussfolgert werden, dass die Kryokonservierung einen vielversprechenden Ansatz zur Langzeitlagerung mikrovaskulärer Fragmente darstellt. Die Ausbildung eines Gefäßnetzwerks durch mikrovaskuläre Fragmente benötigt trotz der ausgezeichneten regenerativen Eigenschaften dieser Vaskularisierungseinheiten mehrere Tage. Daher wurde im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit untersucht, ob dieser Prozess durch Erythropoietin (EPO) weiter verbessert und beschleunigt werden kann. Hierzu wurden GFP-positive mikrovaskuläre Fragmente für 24 h in Medium kultiviert, welches mit EPO oder Vehikel supplementiert wurde. Anschließend erfolgte der Transfer der mikrovaskulären Fragmente auf Integra®-Scaffolds, welche in die Rückenhautkammern von GFP-negativen C57BL/6 Wildtyp-Empfängermäusen implantiert wurden. Mittels intravitaler Fluoreszenzmikroskopie sowie histologischen und immunhistochemischen Analysen wurde die Ausbildung neuer Gefäßnetzwerke über 14 Tage untersucht. EPO verbesserte die Viabilität und Proliferation der Fragmente und induzierte die Expression pro-angiogener Proteine. Entsprechend bildeten sich in den Scaffolds mikrovaskuläre Netzwerke deutlich schneller und dichter aus als in der Kontrollgruppe. Die beschleunigte Netzwerkbildung ging mit einer verbesserten Reifung der Gefäße und einer vermehrten Anzahl von GFP-positiven sowie -negativen Gefäßen im Randbereich um die Implantate einher. Somit kann aus den vorliegenden Ergebnissen geschlossen werden, dass EPO die Vaskularisierungskapazität mikrovaskulärer Fragmente steigert. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit neue Ansätze auf, durch die der Einsatz von mikrovaskulären Fragmenten als Vaskularisierungseinheiten weiter verbessert werden kann. Diese Ansätze können zukünftig wesentlich zum klinischen Erfolg neuer Prävaskularisierungsstrategien im Tissue Engineering beitragen.

Tissue engineering aims on the generation of autologous tissue substitutes. For this purpose, cells are seeded onto carrier matrices, also referred to as scaffolds. The resulting tissue constructs can be implanted into a tissue defect. The rapid vascularization of the implants is crucial for the clinical success of this approach. This can be achieved by the prevascularization of scaffolds with microvascular fragments. These microvascular fragments reassemble into new microvascular networks and develop interconnections to the host microvasculature. Recent studies indicate a reduced vascularization capacity of microvascular fragments from aged donors. To overcome this problem, biobanking of microvascular fragments from young donors has been established in the first part of the present thesis. Microvascular fragments were isolated from epididymal fat pads of C57BL/6 donor mice, cryopreserved at -196 °C for 7 days and subsequently compared with freshly isolated microvascular fragments. Moreover, cryopreserved and freshly isolated microvascular fragments from C57BL/6-TgN(ACTB-EGFP)1Osb/J donor mice were seeded on Integra® scaffolds, which were implanted into dorsal skinfold chambers of green fluorescent protein (GFP)-negative recipient animals. The formation of vascular networks within the implants was analyzed by means of intravital fluorescence microscopy, histology and immunohistochemistry throughout an observation period of 14 days. Scanning electron microscopy and flow cytometry revealed that cryopreservation did not affect the orphology and cellular composition of microvascular fragments, whereas their viability and number were significantly reduced when compared to freshly isolated controls. In addition, cryopreservation elevated the expression level of pro-angiogenic proteins within the microvascular fragments, which resulted in an increased release of growth factors. Accordingly, cryopreserved and control microvascular fragments induced a comparable vascularization of Integra® scaffolds without differences in microvascular network density, maturation, and remodeling. The enhanced angiogenic activity of cryopreserved microvascular fragments even resulted in a higher fraction of GFP-positive microvessels within the implants. These findings indicate that cryopreservation represents a promising concept for the long-term storage of microvascular fragments. Despite the excellent regenerative potential of microvascular fragments, their reassembly into blood-perfused vascular networks still requires several days. The second part of the present thesis analyzed whether this process may be further improved by erythropoietin (EPO). For this purpose, GFP-positive microvascular fragments were cultivated for 24 h in medium supplemented with EPO or vehicle. Subsequently, the microvascular fragments were seeded onto Integra® scaffolds, which were implanted into dorsal skinfold chambers of GFP-negative C57BL/6 recipient mice. The vascularization of the implants was studied by means of intravital fluorescence microscopy, histology and immunohistochemistry throughout an observation period of 14 days. EPO increased the viability and proliferation of microvascular fragments and upregulated their expression of pro-angiogenic proteins. Accordingly, the in vivo formation of vascular networks within implanted scaffolds seeded with EPO-treated microvascular fragments was improved, as indicated by a higher functional microvessel density when compared to controls. This enhanced vascularization was associated with an accelerated microvascular maturation. Moreover, an increased number of GFP-positive and -negative microvessels was detected within the tissue surrounding the scaffolds seeded with EPO-treated microvascular fragments. These findings indicate that EPO further boosts the vascularization capacity of microvascular fragments. Taken together, the present thesis demonstrates new approaches for an improved application of microvascular fragments as vascularization units. In the future, these approaches may markedly contribute to the clinical success of novel prevascularization strategies in tissue engineering.