Charakterisierung der zytoplasmatischen Funktion von Num1 und Nma1 in Ustilago maydis

Der phytopathogene Pilz Ustilago maydis durchläuft verschiedene morphologische Stadien während seines Lebenszyklus, da er als haploid Hefe-artige Sporidien oder infektiöses dikaryotisches Filament wachsen kann. Die Entwicklung erfordert eine präzise Kontrolle des polaren Wachstums, der Zellkern-Verteilung und der Zellzyklus-Kontrolle. Die Deletion des num1-Gens führt in Hyphen zu starken Polaritätsdefekten und beeinträchtigt die Septierung und den vesikulären Transport. Num1 ist ein Homolog des humanen SPF27, einer Kernkomponente des hoch konservierten Prp19/CDC5-Komplexes (NineTeen Complex), der essentielle Funktionen beim Spleißprozess hat. ... mehrDie Identifizierung zytoplasmatisch lokalisierter Interaktionspartner, wie dem Motorprotein Kin1 und dem Mikrotubuli-assoziierten Nma1-Protein, legen eine Verbindung zwischen der Spleiß-Maschinerie und intrazellulären Transportprozessen nahe. Num1 lokalisiert hauptsächlich im Zellkern, es gibt jedoch auch Evidenzen für zytoplasmatische Subpopulationen, deren genaue Lokalisierung aufgrund des niedrigen Signals und der Auflösungsgrenze der konventionellen Fluoreszenzmikroskopie nicht bestimmt werden konnten. Mit Hilfe der hochauflösenden PALM-Technik war es nun erstmals möglich die Num1-Lokalisierung außerhalb des Zellkerns zu verfolgen. Die Bewegung von Num1 ist in Abhängigkeit vom Motor-Protein Kin1, während die Prozesse unabhängig vom Motorprotein Kin3 und frühen Endosomen (EE) ablaufen. In dieser Arbeit war es erstmals möglich, die zytoplasmatische Lokalisierung und Motorprotein-abhängige Motilität eines Spleiß-Faktors zu zeigen.
Das als Num1-Interaktor isolierte Protein Nma1 bewegt sich bidirektional entlang von Mikrotubuli (MT) und interagiert mit Komponenten des CORVET- Komplexes, der die Fusion von Membranen vermittelt. Co-Lokalisierungen mit dem EE-Markerprotein Rab5 zeigen den Co-Transport von Nma1 und EEs. Die Deletionen von kin3, kin1, rab5 und der CORVET-Komponente vps3 beeinträchtigen die Motilität von Nma1 und führen zu stationären Nma1- Signalen entlang von MT. Diese Beobachtungen sprechen für einen EE-abhängigen Transport und einer zusätzlichen direkten Bindung von Nma1 an MT. Während der Mitose kondensiert Nma1 gemeinsam mit Tubulin am Spindelpolkörper (SPK) und später auf astralen MT. Deletionen von kin3, kin1 und rab5 führten zu keiner Veränderung der Nma1-Lokalisierung an den SPK, dies spricht für eine EE-unabhängige direkte Bindung des Proteins an MT. Die Beobachtung von Rab5- und Yup1 markierten EEs am SPK impliziert eine zusätzliche EE-abhängige Lokalisierung von Nma1 am SPK. Untersuchungen in Metazoa ergaben vielfältige Funktionen von Endosomen an der Mitosespindel, wie zum Beispiel bei der Assemblierung der Kernmembran.

During its lifecycle, the phytopathogenic basidiomycete Ustilago maydis passes through different morphological stages, as the haploid yeast-like sporidia and the infectious dikaryotic filament. Proper development requires an accurate controlling between polar growth, nuclear distribution and cell cycle coordination. Deletion of the num1 gene leads to strong polarity defects and impairs septation and vesicular transport. Num1 is a homolog of the human SPF27, a central component of the highly conserved Prp19/CDC5- complex (NineTeen Complex), an integral component of the spliceosome. ... mehrInteraction with several proteins implicated in cytoplasmic transport, as Kin1 and the microtubule-associated Nma1-protein, suggest a connection between the nuclear splicing machinery and intracellular trafficking processes. Num1 localizes mainly in the nucleus, but there is evidence for an additional cytoplasmic subpopulation. However, due to weak signals and diffractions limits of conventional microscopy techniques, it was not possible to visualize the cytoplasmic localization. With the approach of using the super-resolution microscopy method PALM we were able for the first time to track the presence of Num1 outside the nucleus. Num1 transport is Kin1-dependent, but independent from Kin3 and the motility of early endosomes (EE). In this study, the cytoplasmic localization and motor protein-dependent motility of a splicing factor was shown for the first time.
The Num1 interacting protein Nma1 shuttles bidirectionally along microtubules and interacts with components of the membrane tethering CORVET complex. Co-localization experiments with the EE marker protein Rab5 displayed a co- transport of Nma1 and EE. Deletions of kin3, kin1, rab5 and the CORVET- component vps3 altered Num1 motility and led to additional stationary signals along microtubules (MT). These findings suggest an EE-dependent transport of Nma1 and an additional ability to bind directly to microtubules. During mitosis Nma1 condensed together with tubulin and localized at the spindle pole bodies (SPB) and later on astral microtubules. Deletions of kin3, kin1 and rab5 did not alter localization of Nma1 on mitotic spindles. Thus this data proposes EE-independent Nma1 binding to microtubules. Further experiments revealed accumulation of Rab5 and Yup1 marked EEs on SPBs that suggest an additional EE-dependent localization of Nma1. Investigation in metazoan cells uncovered multiple functions of endosomes at mitotic spindles, as the assembly of nuclear membranes.