Identifizierung und Charakterisierung molekularer Mechanismen vaskulärer Umbauprozesse bei pulmonaler Hypertonie

Abstract

Die PH ist eine lebensbedrohliche Erkrankung, die unbehandelt zum Tode führt. Sie ist durch einen erhöhten pulmonalarteriellen Druck, erhöhten pulmonalvaskulären Widerstand sowie die mit PH einhergehenden Gefäßumbauprozesse charakterisiert, die letztendlich zum Rechtsherzversagen führen können. Da die der Erkrankung zu Grunde liegenden Mechanismen noch nicht vollständig entschlüsselt sind, zielen die derzeitigen Behandlungsmöglichkeiten eher auf die Verbesserung der Symptomatik, nicht jedoch auf eine Beseitigung der eigentlichen Ursachen.Im Modell der Hypoxie-induzierten PH der Maus führt eine normoxische Reexposition nach vollständiger Ausbildung der Erkrankung zu einer Gesundung der Versuchstiere. In der vorliegenden Arbeit wurden zur Identifizierung der in diesem Heilungsprozess involvierten Gene genomweite Analysen an Mäusen durchgeführt. Hierbei wurde die S-Adenosylmethionindecarboxylase 1 (AMD-1), ein Enzym der Polyaminsynthese, als ein äußerst stark regulierter Kandidat im Prozess des Revertierens der Hypoxie-induzierten PH gefunden. AMD-1 stellte einerseits eines der am stärksten erniedrigten Gene bei Reoxygenierung dar und andererseits eines der am stärksten erhöhten Gene unter chronisch hypoxischen Bedingungen.Durch in situ Hybridisierung wurde die vermehrte Expression von AMD-1 unter pathophysiologischen Bedingungen einer PH sowohl bei der Maus als auch in humanem Material bestätigt. Des Weiteren zeigte sich eine Lokalisation von AMD-1 in pulmonalen Gefäßen, dem Ort der Umbauprozesse bei PH. Interessanterweise wurde AMD-1 nur in pumonalen Gefäßen unter hypoxischen Bedingungen vermehrt exprimiert und nicht in systemischen Gefäßen, was im Hinblick auf eine pharmakologische Intervention eine gewisse Selektivität für die Lunge versprechen könnte. Unter chronischer hypoxischer Exposition der heterozygoten AMD-1-Knockout-Tiere zeigte sich ein präventiver Phänotyp, der in Verringerung der PH resultierte. Im Gegensatz dazu zeigte eine verminderte Expression der Ornithindecarboxylase 1 (ODC-1), dem zweiten geschwindigkeitsbestimmendem Enzym der Polyaminsynthese neben AMD-1, keinen positiven Effekt auf die Hypoxie-induzierten PH.Des Weiteren konnte diese Arbeit zeigen, dass die Hypoxie-induzierte PH durch vermehrte Proliferation von Zellen der Gefäßwand gekennzeichnet ist, die durch Reoxygenierung normalisiert wurde. Eine verminderte AMD-1-Expression sowohl in vivo als auch in isolierten humanen pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen führte zu einer verminderten Proliferation und induzierte gleichzeitig Apoptose. Schließlich konnte in der vorliegenden Arbeit durch computergestützte Analysen und molekularbiologische Methoden der Signalweg aufgeklärt werden, der über EGF-Erk1/2-Egr1 zu einer erhöhten AMD-1-Expression unter hypoxischen Bedingungen führt. Darüberhinaus konnten die Untersuchungen zeigen, dass AMD-1 für die Phosphorylierung der Phospholipase C-γ1 (PLC-γ1) in humanen pulmonalarteriellen glatten Muskelzellen sowie in der Mauslunge notwendig ist. PLC-γ1 ist ein wichtiges Signalmolekül in der Regulation der Calciumhomöostase und somit ein möglicher, wichtiger Effektor des Gefäßumbauprozesses. Zusammengefasst wurde in dieser Studie über in vivo und in vitro Untersuchungen gezeigt, dass AMD-1 den Gefäßumbauprozess bei pulmonaler Hypertonie in vivo steuern kann und dass genomweite Studien, insbesondere im Prozess der Revertierung einer PH im chronisch hypoxischen Mausmodell geeignet sind, neue essentielle Kandidaten der PH-Pathogenese, die auch Ziel einer Therapie sein könnten, zu identifizieren. PH is a life-threatening disease leading to death if untreated. This disease is characterized by an elevated pulmonary arterial pressure, pulmonary vascular remodeling and an increased pulmonary vascular resistance, ultimately leading to right heart failure. Since the underlying mechanisms of the disease are not fully understood yet, the actually available treatment strategies are rather symptomatic than targeted to resolve the cause of the disease.In the mouse model of hypoxia-induced PH, reexposure to normoxia after full establishment of the disease induces full recovery from PH. In the present study, a genome wide screening was performed to identify genes involved this recorvery process. In this analysis, s-adenosylmethionine decarboxylase 1 (AMD-1), an enzyme involved in polyamine synthesis, was found as an extremely strong regulated candidate in the reversal of hypoxia-induced PH. On the one hand, AMD-1 displayed one of the strongest downregulated genes during reoxygenation, on the other hand, AMD-1 was one of the strongest upregulated genes upon chronic hypoxic exposure.By applying in situ hybridization increased AMD-1 expression was confirmed under pathophysiological conditions of PH in mice as well as in human IPAH samples. Furthermore, localization of AMD-1 was demonstrated in pulmonary vessels, the site of vascular remodeling processes in PH. Interestingly, enhanced AMD-1 expression under hypoxic conditions was only detected in pulmonary vessels in contrast to systemic vessels. This might predict at least some selectivity for the pulmonary circulation when applying pharmacological intervention.Under chronic hypoxic conditions AMD-1+/- mice displayed a preventive phenotyp, resulting in a reduced PH. In contrast, diminished expression of ornithine decarboxylase 1 (ODC-1), the second rate-limiting enzyme of the polyamine synthesis next to AMD-1, did not display preventive effects on hypoxia-induced PH.Furthermore, in this study it was demonstrated that the hypoxia-induced PH was accompanied by increased proliferation of cells from the vessel wall, which was normalized by reoxygenation. Decreased AMD-1 expression in vivo and in vitro led to decreased proliferation and augmented apoptosis. Moreover, by applying computational based analysis and molecular biological methods, a signaling cascade leading to increased AMD-1 expression under hypoxia via EGF-Erk1/2-Egr1 was identified. Furthermore, it was verified that AMD-1 is required for the phosphorylation of phospholipase C-γ1 (PLC-γ1) in hPASMCs and in the mouse lung. PLC-γ1 is a crucial signaling molecule in the regulation of calcium homeostasis and therefore a possible essential effector of vascular remodeling processes. Taken together, it was shown by in vivo and in vitro approaches, that AMD-1 can regulate the vascular remodeling process in pulmonary hypertension in vivo and that genomewide studies, particularly during the process of reversal of PH in the mouse model of chronic hypoxia, are feasible to identify new, essential candidates in the pathogenesis of PH which may also can serve as a possible target for the pharmacotherapy of PH.