Technical developments for online bioprocess monitoring in continuously orbitally shaken microtiter plates

Ladner, Tobias Michael David; Büchs, Jochen; Hitzmann, Bernd

doi:HT019229375

Technical developments for online bioprocess monitoring in continuously orbitally shaken microtiter plates = Technische Weiterentwicklungen zur online Bioprozessüberwachung in kontinuierlich orbital geschüttelten Mikrotiterplatten

Ladner, Tobias Michael David^RWTH*

2017

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Tobias Michael David Ladner

ImpressumAachen 2017

Umfang1 Online-Ressource (XV, 107 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2017

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Büchs, Jochen (Thesis advisor)^RWTH* ; Hitzmann, Bernd (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2017-01-17

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2017-01180
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2017-011808
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/683009/files/683009.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/683009/files/683009.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
microtiter plate (frei) ; high-throughput (frei) ; online monitoring (frei) ; 2D-flourescence spectroscopy (frei) ; bioprocess (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
In der Biotechnologie sind geschüttelte Bioreaktoren weit verbreitet. Insbesondere Mikrotiterplatten werden immer häufiger als Bioreaktoren in frühen Stadien der Prozessentwicklung eingesetzt. Mit Mikrotiterplatten basierten Kultursystemen können zahlreiche Versuche parallel und binnen kurzer Zeit durchgeführt werden. Zusätzlich werden aufgrund des reduzierten Materialeinsatzes Kosten eingespart. Als Bioreaktor werden Mikrotiterplatten heute weitestgehend in Kombination mit orbital rotierenden Schüttelmaschinen eingesetzt. Aufgrund der orbitalen Schüttelbewegung wirkt die Zentrifugalkraft auf die Kulturbrühe, was zur Ausbildung einer rotierenden Flüssigkeitssichel führt. Neben einer Durchmischung der Kulturbrühe bewirkt dies auch eine Vergrößerung der Gas-Flüssigkeits-Austauschfläche, welche wiederum die Sauerstoffversorgung der Mikroorganismen begünstigt.Das Potential solcher Kleinkultursysteme wird jedoch erst ausgeschöpft, wenn auch eine Überwachung der ablaufenden Reaktionen in den einzelnen Bioreaktoren (möglichst in Echtzeit) erfolgt. Mit Hilfe der BioLector Technologie, welche auf der optischen Prozessüberwachung mittels Fluoreszenz und Lichtrückstreuung basiert, werden bereits zahlreiche Prozessparameter wie die Biomasse, NADH oder Flavin während der Kultivierung in orbital geschüttelten Mikrotiterplatten verfolgt. Weitere wichtige biotechnologische Prozessparameter wie der pH-Wert und die Gelöstsauerstoffkonzentration (DOT) können jedoch nicht direkt über Fluoreszenz bestimmen werden. Zur deren Bestimmung können prinzipiell aber Fluoreszenzfarbstoffe eingesetzt werden, die ihr Fluoreszenzverhalten in Abhängigkeit der jeweiligen Konzentrationen ändern. Bislang ist es üblich, die sensitiven Fluoreszenzfarbstoffe in Mikrotiterplatten auf dem Wellboden zu immobilisieren. Diese optischen Sensorspots werden auch als Optoden bezeichnet. In der Literatur wurde jedoch aufgezeigt, dass Interferenzen zwischen biogener Fluoreszenz und dem Fluoreszenzfarbstoff auftreten können, die dann fehlerhafte Messergebnisse generieren.In der vorliegenden Arbeit wird ein alternatives, ebenfalls auf einem Fluoreszenzfarbstoff basierendes Messsystem zur Überwachung der DOT in orbital geschüttelten Mikrotiterplatten vorgestellt. Der sensitive Fluoreszenzfarbstoff wird mit rotem Licht angeregt. Zur Bestimmung der DOT wird das emittierte Licht im Nah-Infrarotbereich gemessen. Als Rohsignal wird bei dieser Methode die Fluoreszenzlebensdauer ausgewertet. Der Messbereich liegt außerhalb des Bereichs biogener Fluoreszenz. Interferenzen mit dem Messsystem treten daher nicht auf. Ein weiterer Vorteil dieses Messsystems besteht darin, dass der verwendete Fluoreszenzfarbstoff an Nanopartikeln immobilisiert ist, die einfach der Kulturbrühe zugegeben werden können. Entsprechend kann das Messsystem mit beliebigen Mikrotiterplatten verwendet werden und eine Abhängigkeit von Optoden ist nicht länger gegeben. Diese DOT-Messtechnik wurde in einem BioLector integriert und erfolgreich zur Überwachung mikrobieller Systemen eingesetzt. Es wurde gezeigt, dass die dispergierten sauerstoffsensitiven Nanopartikel das Wachstumsverhalten von Gluconobacter oxydans, Hansenula polymorpha und Escherichia coli nicht beeinflussen.Ein BioLector, ausgestattet mit der oben beschriebenen alternativen DOT-Messtechnik, wurde in der vorliegenden Arbeit zusätzlich mit der sogenannten µRAMOS Technik kombiniert. µRAMOS ermöglicht die gleichzeitige Bestimmung der Sauerstofftransferrate (OTR) in jedem einzelnen Well einer 48-Well-Mikrotiterplatte. Da sowohl die BioLector Technologie als auch die µRAMOS Technik auf optischen Messsignalen basiert, wurde ein Messzyklus vonnöten, der eine interferenzfreie Messung sicherstellt. Mit dem neu entwickelten Versuchsaufbau werden in einem einzigen Versuch erstmals gleichzeitig Daten gewonnen, die in der Vergangenheit lediglich aus der Kombination von aufwendigen parallel durchgeführten Schüttelkolben- und Mikrotiterplattenexperimenten erhalten werden konnten. Durch die Kombination beider Messsysteme wurde es zudem möglich, den volumetrischen Sauerstofftransferkoeffizienten (kLa) während E. coli Kultivierungen zu bestimmen. Die hier bestimmten kLa-Werte stimmen sehr gut mit einer aus der Literatur bekannten empirischen Korrelation überein.Ähnlich der DOT, können noch weitere wichtige Prozessparameter nicht direkt mittels Fluoreszenz bestimmt werden. So sind beispielsweise die in vielen Kulturmedien enthaltenen Kohlenstoffquellen Glukose und Glycerin nicht fluoreszenzaktiv. Für diese Substanzen sind bisher jedoch keine selektiven Fluoreszenzfarbstoffe bekannt. Um diese Prozessgrößen dennoch nichtinvasiv bestimmen zu können, kann aber auf die sogenannte 2D-Fluoreszenzspektroskopie zurückgegriffen werden. Bei der 2D-Fluoreszenzspektroskopie werden mehrere Anregungs- und Emissionsspektren einer Probe aufgenommen und als Anregung vs. Emission Matrix (2D-Fluoreszenzspektrum) zusammengefasst. Zur Auswertung der während der Kultivierung aufgenommenen 2D-Fluoreszenzspektren und der damit verbundenen großen Datenmengen müssen chemometrische Methoden wie die „Partial Least Squares" (PLS) Regression verwendet werden. Dieses Vorgehen wurde bisher lediglich in Rührkesselreaktoren (mit einem Arbeitsvolumen > 1 L) realisiert, da mit gewöhnlichen Fluoreszenzspektrometern bisher keine ausreichend hohe Aufnahmerate zur gleichzeitigen Überwachung aller Wells in Mikrotiterplatten erzielt werden konnte. In der vorliegenden Arbeit wurde dieses Messprinzip erstmals auf Mikrotiterplatten übertragen. Zur Realisierung einer ausreichend hohen Aufnahmerate wurde eine Spektrometer, basierend auf einer „Charge Coupled Device“ (CCD) Kamera in einen BioLector, integriert, wodurch komplette Emissionsspektren auf einmal aufgenommen werden können. Um zuverlässige Messungen zu gewährleisten wurde eine umdrehungsaufgelöste Messung etabliert. In Kultivierungen von H. polymorpha und E. coli wurden die Anwendbarkeit des Systems zur Bestimmung der Konzentrationen von Glukose, Glycerin und Acetat sowie dem pH-Wert über die Zeit demonstriert.Die in dieser Arbeit entwickelten Überwachungstechniken für Kleinkultursysteme, ermöglichen nun den Zugriff auf Prozessparameter die bisher nicht einfach und zuverlässig bestimmt werden konnten. Die neu entwickelten Systeme gestatten dem Anwender einen wesentlich tieferen Einblick in die untersuchten Kultivierungen. Die klare Trennung zwischen sekundärem Screening und Prozessentwicklung verschwimmt damit zusehends.

Shaken bioreactors are widespread in the field of biotechnology. Especially, microtiter plates are increasingly used as bioreactors in the early stages of process development. Microtiter plates allow for the investigation of numerous parallel experiments within a short period of time. Furthermore, microtiter plates offer economic advantages compared to larger systems due to reduced material consumption. When used as a bioreactor, microtiter plates are mostly used as bioreactor in combination with shakers with an orbital shaking movement. Due to the orbital shaking movement, the centrifugal force acts on the culture broth and leads to the formation of a rotating liquid sickle. In addition to mixing of the culture broth, the motion of the liquid also increases the gas-liquid exchange surface, which increases the supply of oxygen to microorganisms.However, the full potential of small-scale systems is only guaranteed if (online) monitoring for each bioreactor is available. BioLector technology, an optical monitoring system based on fluorescence and scattered light measurements, allows for the online monitoring of various process parameters such as biomass, NADH and flavin levels during cultivation in orbitally shaken microtiter plates. pH value and dissolved oxygen tension (DOT) are also important biotechnological process parameters. Unfortunately, these parameters cannot be determined directly by fluorescence measurements. Sensitive fluorescent dyes are available for both measurements; these dyes change their fluorescence behavior depending on the respective concentrations. In microtiter plates, these sensitive fluorescent dyes are commonly immobilized at the well bottom. These optical sensor spots are also called optodes. However, previous studies have found interferences between biogenic fluorescence and the fluorescent dyes, leading to erroneous results.In the present work, an alternative measurement system for DOT monitoring in orbitally shaken microtiter plates based on a fluorescent dye was established. The fluorescent dye chosen for DOT determination is excited with red light and emits light in the near-infrared region. With this technique, fluorescence lift time is used as a raw signal. The measurement is conducted outside of the biogenic fluorescence region to prevent interference. Another advantage is that the fluorescent dye is immobilized on nanoparticles, which can easily be added to the culture broth. Accordingly, the system can be used with any type of microtiter plate, as there is no dependence on microtiter plates equipped with optodes. Furthermore, it was shown that dispersed oxygen-sensitive nanoparticles do not influence the growth behavior of Gluconobacter oxydans, Hansenula polymorpha or Escherichia coli.In the present thesis, a BioLector device equipped with the above-mentioned alternative DOT measurement system was combined with the so-called µRAMOS technique. µRAMOS allows for the online determination of the oxygen transfer rate (OTR) in each well of a 48-well-microtiter plate. Because both techniques are based on optical measurement signals, a measuring cycle was developed to obtain interference-free measurements. For the first time, with this new device, multiple data can be collected simultaneously by means of a single experiment. In the past, the combination of elaborated parallel shake flask and microtiter plate experiments were required. By combining both techniques, it was also possible to calculate the volumetric oxygen transfer coefficient (kLa) during E. coli culture. The estimated kLa values are in excellent agreement with an empirical correlation found in the literature.Similar to the DOT, other important process parameters cannot be determined directly via fluorescence. For example, glucose and glycerol are often used as carbon sources in culture media. Unfortunately, these compounds are not fluorescent. No sensitive fluorescent dyes for these substances are commercially available so far. However, multi-wavelength (2D) fluorescence spectroscopy can be applied to determine such process parameters non-invasively. In multi-wavelength (2D) fluorescence spectroscopy, multiple excitation and emission spectra are acquired and combined to an excitation vs. emission matrix (multi-wavelength (2D) fluorescence spectrum). To evaluate the acquired multi-wavelength (2D) fluorescence spectra and great amount of associated data, chemometric methods such as the “Partial Least Squares” (PLS) regression must be applied. So far, this approach has been applied to stirred-tank reactors (with a working volume > 1 L) because the acquisition rates of common fluorescence spectrometers are too slow to monitor each well in microtiter plates. This was overcome by the integration of a “Charge Coupled Device” (CCD) detector-based spectrometer with a BioLector device, which allowed for simultaneous acquisition of the entire emission spectrum. To ensure reliable measurements, a resolution-resolved measurement was established. The usefulness of the new device for online monitoring of glucose, glycerol and acetate concentrations as well as the pH value over time was demonstrated in cultures of H. polymorpha and E. coli.In the present work, different monitoring techniques for small-scale culture systems are described. These techniques provide valuable process parameters that were not easily and reliably accessible beforehand. By means of these novel developed techniques, the user gains significant insight into the investigated cultures. Thus, the clear distinction between secondary screening programs and process development has become noticeably blurred.

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