Determination of intrinsic enzyme reaction kinetics using thermodynamic activities

Grosch, Jan-Hendrik; Büchs, Jochen; Pohl, Martina; Spieß, Antje

doi:35417

Determination of intrinsic enzyme reaction kinetics using thermodynamic activities = Bestimmung intrinsischer Enzymkinetiken auf Basis thermodynamischer Aktivitäten

Grosch, Jan-Hendrik

2016

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Jan-Hendrik Udo Fritz Grosch

ImpressumAachen 2016

Umfang1 Online-Ressource (XXVI, 186 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, Rheinisch-Westfälische Technische Hochschule Aachen, 2016

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Spieß, Antje (Thesis advisor) ; Büchs, Jochen (Thesis advisor)^RWTH* ; Pohl, Martina (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-07-08

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-083838
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/672912/files/672912.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/672912/files/672912.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Lehrstuhl für Enzymprozesstechnik (420110)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
non-conventional media (frei) ; biocatalysis (frei) ; microtiter plate (frei) ; edge effects (frei) ; Lactobacillus brevis (frei) ; alcohol dehydrogenase (frei) ; Candida parapsilosis (frei) ; carbonyl reductase (frei) ; enzyme kinetics (frei) ; thermodynamic activities (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Bei der Entwicklung wettbewerbsfähiger biokatalytischer Reaktionssysteme ist die Auswahl geeigneter Lösungsmittel besonders wichtig. Bislang beruht diese Auswahl zumeist auf dem Prinzip von Versuch und Irrtum, da die im Verlauf der Reaktion zu Grunde liegenden thermodynamischen Phänomene und kinetischen Effekte zumeist unbekannt sind. Um eine rationale Auswahl des Reaktionsmediums zu ermöglichen, müssen sie identifiziert und charakterisiert werden. Die Effekte können unterteilt werden in (I) Veränderungen der thermodynamischen Aktivitäten der Reaktanden und in (II) Änderungen der intrinsischen Reaktionsparameter. Ziel dieser Arbeit ist es, mittels kinetischer und thermodynamischer Modellierung beide Effekte am Beispiel der für Oxidoreduktasen voneinander zu trennen, um so eine Identifizierung der intrinsischen kinetischen Parameter in einphasigen wassermischbaren Lösemitteln zu erlauben. Die Arbeit kann dabei in drei Aspekte unterteilt werden:Als erstes werden die Carbonylreduktase aus Candida parapsilos (CPCR2) und die Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis (LbADH) als mögliche Modellenzyme untersucht und quantitativ charakterisiert. Hierzu werden Inaktivierungsphänomene wie Oxidation, Dissoziation, Scherkräfte und Adsorption an Grenzflächen im Mikroliter-Maßstab anhand kinetischer Analysen untersucht und quantifiziert. Für die CPCR2 wird eine komplexe Enzyminaktivierung beobachtet, die primär durch Grenzflächeneffekte und Dimerdissoziation gekennzeichnet ist. Für die LbADH wird nur bei geringer Proteinkonzentration eine Tetramerdissoziation beobachtet, die mathematisch sehr gut durch eine Zerfallsgleichung erster Ordnung beschrieben werden kann.Als zweites wird die Belastbarkeit der kinetischen Experimente im Mikroliter-Maßstab in Küvetten und Mikrotiterplatten (MTP) untersucht. Bei der Verwendung von MTP häufig auftretende Probleme wie ungleichmäßige Temperatur- und Verdunstungsprofile werden evaluiert. Der Temperaturgradient innerhalb einer MTP beträgt bis zu 2,2 °C. Die hierdurch hervorgerufene Abweichung der Enzymaktivität beläuft sich auf bis zu 20% innerhalb einer MTP und auf 40% im Verhältnis zu Messungen in Küvetten. Die beobachteten Anfangsgeschwindigkeiten zeigen einen systematischen Anstieg von Polystyrol- zu Quartz-MTP und Quartz-Küvetten, wobei der bestimmte experimentelle Fehler in eben dieser Reihenfolge sinkt (18 auf 2%). Während sich die bestimmten mikrokinetischen Parameter für die einzelnen experimentellen Systeme um Größenordnungen unterscheiden können, unterscheiden sich die berechneten makrokinetischen Parameter zwischen den Systemen um höchstens den Faktor 2 bis 3. Als drittes wurde MTBE als Modell-Lösemittel eingesetzt, da es sowohl gute Enzymstabilitäten als auch eine Veränderung der thermodynamischen Aktivitäten, die mittels COSMO-RS berechnet wurden, zeigt. Kinetische Versuche bei identischen und gezielt unterschiedlichen thermodynamischen Aktivitäten der Reaktanden wurden für die Schätzung mechanistischer Parameter genutzt. Obwohl mittels konzentrationsbasierter Schätzung ein positiver MTBE Einfluss auf die Reaktion bestimmt werden konnte, zeigen die thermodynamisch korrigierten kinetischen Daten einen negativen Effekt steigender MTBE-Konzentrationen auf das Enzym. Damit konnten erfolgreich Rückschlüsse auf die Wechselwirkung zwischen Lösemittel und Enzym gezogen werden.Im Rahmen dieser Arbeit wird die Bedeutung einer rationalen Analyse und eines grundlegenden Verständnisses des experimentellen Systems in der Biokatalyse deutlich. Erfolgreich wurde die Trennung von intrinsischen Kinetiken und thermodynamischen Effekten gezeigt. Dies ermöglicht in Zukunft ein tiefergehendes Verständnis des Verhaltens von Biokatalysatoren in organischen Lösungsmitteln. Die Wechselwirkungen zwischen Lösungsmittel und Enzym können damit weiter beleuchtet werden, womit sich ein Weg zur rationalen Auswahl des Reaktionsmediums bietet.

Solvent selection plays a major role in economically competitive biocatalytic reaction systems. Until now, solvent selection relies on trial and error, since thermodynamic phenomena and kinetic effects during reactions are poorly understood. To allow for rational medium engineering, the effects of organic solvents on biocatalytic reaction systems have to be identified. These effects can be divided into (I) changes of the thermodynamic activities of the reactants and (II) changes of the intrinsic enzyme kinetic parameters. By combining high-throughput experimentation with reaction kinetic modeling and thermodynamic prediction, this work aims for the discrimination of thermodynamic and kinetic effects on oxidoreductase reaction in water-miscible monophasic organic solvents, in order to provide a basis for a rational choice of these solvents. The work can be divided into three packages. First, a thorough quantitative inactivation study is applied on Candida parapsilosis carbonyl reductase (CPCR2) and on Lactobacillus brevis alcohol dehydrogenase (LbADH) as model catalysts. Possible inactivation phenomena are quantified on microliter scale with respect to their effect on kinetic assays in order to derive a suitable mathematical inactivation model. For CPCR2, the results demonstrate that interface interactions and dimer dissociation are the main reasons for inactivation resulting in a complex inactivation scheme. For LbADH, tetramer dissociation has been observed at low protein concentration. This can be mathematically described by a first-order inactivation model. Second, reliable experimentation in micro-scale enzyme assays is required. Thus, typical problems occurring in MTPs such as temperature deviations or evaporation were evaluated. Internal thermal gradients within a polystyrene MTP of up to 2.2° C and even higher deviations from the set temperature were observed, which caused a variation in the corresponding enzyme activity of up to 20% and the deviations in relation to experiments in cuvettes by up to 40%. Subsequently, the reproducibility and precision of enzyme kinetic assays in different microliter scale systems were thoroughly analyzed. The initial reaction rates increased systematically from polystyrene MTPs to quartz MTPs to quartz cuvettes, whereas the experimental errors decreased in the same order (18 to 2%). While the microkinetic parameters vary up to an order of magnitude between different systems, the corresponding macrokinetic parameters lie in the same range for all systems varying only by up to a factor of 2 to 3.Third, MTBE was selected as model solvent providing reasonable LbADH stability and effect on thermodynamic activity as predicted using the COSMO-RS model. Kinetic experiments at both identical and purposefully different thermodynamic activities were used for kinetic modeling. Although MTBE seems to have an overall positive effect on the enzymatic reaction if examined on basis of concentration, solvation-corrected data suggest a negative effect of increasing MTBE concentration on the enzyme. It is assumed that MTBE hinders the intrinsic enzyme catalytic steps and compromises the performance of the enzyme, which is also indicated by the kinetic parameters. Overall, the importance of rational analysis and understanding of the experimental environment in biocatalysis is highlighted in this work. Important steps were taken to develop a proof of concept for kinetic modeling based on thermodynamic activities. This might provide better understanding of the behavior of biocatalysts in organic solvents. Solvent-enzyme interactions might be further elucidated rationally and, thereby, lead to a rational medium engineering.

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