Robot-assisted phenotyping of genome-reduced Corynebacterium glutamicum strain libraries to draft a chassis organism

Unthan, Simon; Wiechert, Wolfgang; Büchs, Jochen

doi:1866-1807

Robot-assisted phenotyping of genome-reduced Corynebacterium glutamicum strain libraries to draft a chassis organism = Robotergestützte Phänotypisierung genomreduzierter Corynebacterium glutamicum Stämme zur Konstruktion eines Chassis-Organismus

Unthan, Simon

2016

VerantwortlichkeitsangabeSimon Unthan

ImpressumJülich : Forschungszentrum Jülich GmbH, Zentralbibliothek 2016

Umfang1 Online-Ressource (122 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

ReiheSchriften des Forschungszentrums Jülich. Reihe Schlüsseltechnologien / Key Technologies ; 132

Dissertation, RWTH Aachen University, 2015

Druckausgabe: 2016. - Onlineausgabe: 2016. - Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor) ; Büchs, Jochen (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2015-10-22

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-074839
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/670366/files/670366.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/670366/files/670366.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Lehrstuhl für Computational Systems Biotechnology (FZ Jülich) (420410)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Corynebacterium glutamicum (frei) ; systems biology (frei) ; synthetic biology (frei) ; genome reduction (frei) ; chassis (frei) ; bioprocess automation (frei) ; liquid handling robotics (frei) ; phenotyping (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Die vorliegende Promotionsarbeit war integraler Bestandteil eines vom BMBF geförderten Verbundprojektes zur Genomreduktion von Corynebacterium glutamicum. Ziel war die Entwicklung und Anwendung von Strategien zur Konstruktion eines Chassis-Organismus durch Identifikation und Deletion irrelevanter Gencluster. Zielkriterium der konstruierten Stämme war deren unveränderte biologische Fitness gegenüber der Wildtyp-Form, beurteilt über spezifische Wachstumsgeschwindigkeit und Biomasseausbeute, beim Wachstum auf definiertem CGXII Medium mit D-Glukose.Unter Verwendung des am IBG-1 verfügbaren Mini Pilot Plant wurden Prozesse zur schnellen Stamm-Phänotypisierung automatisiert und standardisiert. Dazu zählen insbesondere die Schwellwert-abhängige Ernte von zellfreien Überständen aus Mikrotiterplatten-Kultivierungen sowie die parallele Quantifizierung von D-Glukoseund Aminosäuren im 384-well Mikrotiterplatten-Maßstab [1].In ersten Referenzexperimenten wurde Protocatechuat als verborgenes Co-Substrat im CGXII Medium identifiziert. In verdünnten Kulturen erhöht der zusätzliche Kohlenstofffluss aus Protocatechuat über Acetyl-CoA und Succinyl-CoA in den Zitratzyklus die Wachstumsgeschwindigkeit von C. glutamicum um etwa 50 % [2].Zu Beginn der Konstruktion eines Chassis-Organismus wurden drei Prophagen aus dem Wildtyp und damit 6.7 % des Genoms von C. glutamicum deletiert. Der resultierende Stamm MB001 zeigte eine unveränderte biologische Fitness sowie eine gesteigerte spezifische Expression heterologer Proteine. Weitere Untersuchungen zeigten, dass diese Steigerung vermutlich durch die Entfernung eines Restriktions- und Modifikationssytems verursacht wurde, welches im Prophagen CGP3 lokalisiert ist [3].Anschließend wurden 36 nicht-essentielle Gencluster aus dem Stamm MB001 deletiert. Durch Phänotypisierung der Mutanten-Stämme konnten 26 irrelevante Gencluster identifiziert werden, wobei durch deren komplette Deletion das Genom von C. glutamicum um insgesamt 22 % reduziert werden könnte [4]. Parallel wurdenausgewählte Gencluster auch aus dem L-Lysin Modellproduzenten DM1933 deletiert. Hierbei zeigte der genomreduzierte Stamm GRLP45 in der Mikrotiterplatte um 51 % erhöhte L-Lysintiter, was im geregelten Bioreaktorsystem bestätigt werden konnte [1].Bei Untersuchungen von Stämmen mit kombinatorischen Deletionen irrelevanter Gencluster wurden teilweise Abhängigkeiten einzelner Gencluster identifiziert, welche zu einer verringerten biologischen Fitness der betreffenden Mutanten führten. Die detaillierte Charakterisierung der Mutante W65 zeigte einen Zusammenhang zwischen der Anzahl Ribosomen-kodierender Sequenzen und der maximalen Wachstumsrate.Schließlich konnten die Kombinationsstämme W127 und W121 identifiziert werden, welche eine Genomreduktion von 8.8 % und 12.8 % aufweisen, welche das gesetzte biologische Fitnesskriterium erfüllen. W121 zeigte eine veränderte Morphologie, deren Ursache über die Stammdatenbank des Projektes auf ein einzelnes Gencluster eingegrenzt werden konnte. Stamm W127 zeigte hingegen auch unter Stressbedingungen unverändertes Wachstum und stellt eine geeignete strukturelle Basis für zukünftige Arbeiten der synthetischen Biologie mit C. glutamicum dar.

In this work, concepts were developed and applied to guide the construction of a Corynebacterium glutamicum chassis organism for synthetic biology approaches. The aim was to delete irrelevant genes from the wild type strain in order to obtain a chassis growing on defined CGXII medium with D-glucose with unaltered biological fitness, which was defined by the maximum specific growth rate and biomass yield.Initially, workflows were developed on a robotic Mini Pilot Plant (MPP), for example, to harvest cell-free cultivation supernatants from BioLector cultivations in response to individually defined triggers. Subsequently, assays for amino acids and D-glucose were established in 384-well plate scale in order to quantify these metabolites in cell-free culture supernatants in fully automated workflows [1].During initial reference experiments, protocatechuic acid was identified as a hidden co-substrate in the well-known defined CGXII medium. The additional TCA feed via acetyl-CoA and succinyl-CoA, which are derived from protocatechuic acid, elevates the growth rate by about 50 % in highly diluted cultures [2].The first step toward a chassis was the deletion of prophage elements contributing to about 6.7 % of the C. glutamicum genome. The respective strain MB001 showed unaltered biological fitness and an increased heterologous protein expression, caused by the removal of a restriction-modification system in prophage CGP3 [3].As a next step, 36 strains with deletion of non-essential gene clusters were tested thoroughly and 26 clusters were found irrelevant for the biological fitness of C. glutamicum and offered the potential to reduce the genome by about 22 % [4]. Some clusters were also deleted in the L-lysine model producer DM1933 and the derived strain GRLP45 showed an 51 % increased L-lysine titer applying the automated MPP methods, what was finally confirmed in lab-scale bioreactors [1].During the final combinatorial deletion of irrelevant gene clusters, some interdependencies were observed resulting in a decreased of biological fitness of the respective strains. One of those strains was characterized in-depth and revealed the general interplay of ribosome capacity and maximum growth rate of C. glutamicum.In the end, two pre-chassis, namely W127 and W121, were obtained that displayed a total genome reduction of 8.8 % and 12.8 %, respectively. Both strains fulfilled the target criteria of unaltered biological fitness on defined CGXII medium in BioLector cultivations. Finally, the in-depth analysis of both pre-chassis in bioreactors revealed a morphological divergence of W121 which could be narrowed down to a single cluster deletion. However, W127 did not show any drawback compared to the wild type when tested under stress conditions and on different cultivation scales. In fact, this strain even grew faster on some C-sources, making it a good basis for synthetic biology approaches.

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