High-throughput live-cell imaging for investigations of cellular heterogeneity in Corynebacterium glutamicum

Helfrich, Stefan; Wiechert, Wolfgang; Usadel, Björn

doi:1866-1807

High-throughput live-cell imaging for investigations of cellular heterogeneity in Corynebacterium glutamicum = Hochdurchsatz Live Cell Imaging für Untersuchungen zellulärer Heterogenität in Corynebacterium glutamicum

Helfrich, Stefan

2016

VerantwortlichkeitsangabeStefan Helfrich

ImpressumJülich : Forschungszentrum Jülich GmbH 2016

Umfang1 Online-Ressource (xvi, 217 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

ISBN978-3-95806-167-5

ReiheSchriften des Forschungszentrums Jülich. Reihe Schlüsseltechnologien ; 130

Dissertation, RWTH Aachen University, 2016

Druckausgabe: 2016. - Onlineausgabe: 2016. - Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Wiechert, Wolfgang (Thesis advisor) ; Usadel, Björn (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2016-05-12

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-rwth-2016-068860
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/668584/files/668584.pdf
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/668584/files/668584.pdf?subformat=pdfa

Einrichtungen

Lehrstuhl für Computational Systems Biotechnology (FZ Jülich) (420410)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
image analysis (frei) ; single-cell analysis (frei) ; modelling (frei) ; population heterogeneity (frei) ; Corynebacterium glutamicum (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
In den vergangenen 15 Jahren wurden signifikante Unterschiede zwischen einzelnen Zellen im Bezug auf Wachstum, Stressresistenz und andere zelluläre Merkmale in monoklonalen Bakterienpopulationen beobachtet. Fortschritte in Mikrofluidik und Mikroskopie ermöglichen es die Entwicklung einzelner Zellen mit bisher nicht gekannter räumlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen. In Verbindung mit optimierten, mikrofluidischen Labs-on-a-Chip, können hunderte Bakterienpopulationen unter kontrollierten Umweltbedingungen kultiviert und Bildsequenzen aufgezeichnet werden. Mit der Möglichkeit große Datenmengen automatisiert zu erzeugen, ist die Auswertung der Bilddaten zu dem entscheidenden Schritt für die Erhebung von quantitativen, zeitaufgelösten Informationen geworden. Daher wurde eine erweiterbare Bildanalyse- Pipeline für die Auswertung von Bildsequenzen des biotechnologischen Modellorganismus Corynebacterium glutamicum entwickelt. Die Pipeline ist für die Identifizierung von Zellen in gedrängten Umgebungen optimiert, sowie für das Tracking von Zellen bei großer räumlicher Verschiebung. Zusätzlich können eine Vielzahl von Zelleigenschaften, wie zum Beispiel morphologische Parameter und Fluoreszenzintensitäten, extrahiert werden. Die Bildanalysepipeline ist als Plugin für die ImageJ(2) Plattform implementiert worden. ImageJ(2) stellt fortschrittliche Datenstrukturen zu Verfügung und ermöglicht das Steuern von Abläufen mit Hilfe einer graphischen Benutzeroberfläche. Die zugrundeliegende Service-Architektur fördert die Erweiterbarkeit und Flexibilität von Modulen, so dass diese auch in anderen Plugins verwendet werden können. Mit einer Kombination aus Mikrofluidik, Live-Cell Imaging Verfahren und Bildanalysetechniken ist man in der Lage Heterogenität in mikrobiellen Populationen auch bei niedriger zeitlicher Auflösung zu quantifizieren. Während die Analyseplattform für eine Vielzahl von Untersuchungen angewendet wurde, liegt der Fokus in dieser Arbeit auf zwei Anwendungsfeldern: mikrobielles Wachstum und Morphologie sowie Prophageninduktion in C. glutamicum. Im Rahmen der Wachstumsstudien wird die Übertragbarkeit von etablierten Quantifizierungsmethoden auf Einzelzelldaten untersucht. Eine zweite Anwendung auf diesem Gebiet überträgt die gewonnenen Erkenntnisse auf eine Screening-Studie von C. glutamicum, in welcher der Einfluss der Medienkomposition auf das Wachstum und die morphologischen Parameter untersucht wird.In einem zweiten Anwendungsfeld wird eine Analyse der mikrobiellen Stressantwort und die Induktion eines Prophagen in C. glutamicum beleuchtet. Zu diesem Zweck ist ein Dual-Reporter-Stamm (d.h. ein Stamm mit beiden Reportern für SOS-Antwort und Prophagen-Induktion) in mikrofluidischen Labs-on-a-Chip kultiviert und mittels Fluoreszenzmikroskopie analysiert worden. Aus den zeitaufgelösten Reporterdaten wurde ein Zellzustandsmodell abgeleitet, welches für die Populationsmodellierung von C. glutamicum verwendet wurde.

Significant cell-to-cell variation with respect to growth, stress resistance, and other cellular traits are observed in clonal microbial populations. Advances in lab-on-a-chip research and time-lapse microscopy have recently extended the experimental capabilities to observe the development of individual cells with unprecedented spatial and temporal resolution. In combination with appropriate cultivation devices, e.g., custom microfluidic lab-on-a-chip devices, image sequences are acquired for hundreds of developing populations in parallel under controlled environmental conditions. With the possibility to generate such large-scale datasets, the role of image analysis has become a crucial step for the elicitation of quantitative, time-resolved information for direct interpretation as well as modeling purposes. We have developed an extensible image analysis pipeline for the evaluation of time-lapse videos of the industrially competitive amino-acid producer Corynebacterium glutamicum. The pipeline has been optimized for the identification of cells in crowded environments, tracking of cells with large spatial displacements, and the extraction of a multitude of cellular characteristics, for instance, cell morphology and fluorescence reporter intensities. The presented pipeline is implemented as a plugin for the well established ImageJ(2) platform. The platform provides advanced data structures and allows for visual controls of workflow composition and parameters. The underlying service architecture promotes extensibility of modules and flexibility to use implementations in alternative contexts. The combination of microfluidic system, live-cell imaging setup, and image analysis techniques is capable to address challenges of population heterogeneity in microbial populations even at low temporal resolution. While the analysis platform has been applied for a variety of studies, applications from two fields are highlighted in this thesis.First, investigations of microbial growth and morphology of C. glutamicum. Here, the applicability of growth quantification methods from bulk experiments to single-cell data are investigated. A second application transfers this knowledge to a profiling study of C. glutamicum in which the influence of medium composition (i.e., carbon sources) on growth and morphology parameters is analyzed.Furthermore, an analysis of the microbial SOS response and the induction of a prophage in C. glutamicum is presented. To that end, a dual reporter strain (i.e., reporters for SOS response and prophage induction) is cultivated in lab-on-a-chip devices and analyzed using fluorescence microscopy. From the time-resolved reporter outputs, we have established a cellular state model that is used for comprehensive population modeling.

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