Submerged vinegar fermentation in small scale culture systems

Schlepütz, Tino; Büchs, Jochen

doi:4738

Submerged vinegar fermentation in small scale culture systems = Submerse Essigfermentation in Kleinkultursystemen

Schlepütz, Tino (Author)

2013

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Tino Schlepütz

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2013

UmfangX, 102 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2013

Zsfassung in dt. und engl. Sprache

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2013-08-27

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-47384
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/231108/files/4738.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Fermentation (Genormte SW) ; Essig (Genormte SW) ; Aerobe Bakterien (Genormte SW) ; Essigsäurebakterien (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Kleinkultursysteme (frei) ; fermentation (frei) ; vinegar (frei) ; obligatory aerobic bacteria (frei) ; acetic acid bacteria (frei) ; small scale culture systems (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Industriell wird Essig weitgehend durch submerse Fermentation hergestellt. Obwohl diese im großen Maßstab etabliert ist, fehlen Kleinkulturmethoden, in denen heutzutage Bioprozesse entwickelt und optimiert werden. Um den etablierten Fermentationsprozess neu zu beforschen, war die Entwicklung von geeigneten Kleinkulturmethoden und Systemen für die submerse Essigfermentation das Ziel dieser Arbeit. Da die obligat aeroben Essigsäurebakterien in der Essigherstellung bei herkömmlichen Animpfschritten selbst unter kurzem Sauerstoffmangel leiden, ist die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse aus der Hauptkultur unzureichend. Durch Gewährleistung eines ständigen Sauerstoffeintrags beim Animpfen wurde eine reproduzierbare Kleinkulturmethode für obligat aerobe Essigsäurebakterien unter industriell relevant hohen Ethanol- und Essigsäurekonzentration entwickelt. Die Vorkultur wurde aus einem 9 L-Bioreaktor in eine begaste, mobile Blasensäule abgelassen und in eine bereits schüttelnde RAMOS-Anlage überführt. Die Atmungskurven herkömmlich behandelter Essigsäurebakterienkulturen waren niedrig und wichen stark voneinander ab. Die Atmungskurven der Essigsäurebakterienkulturen, bei denen die Vorkultur zuerst in die Blasensäule und dann in die bereits schüttelnden Schüttelkolben überführt wurde, waren hoch und überlagerten sich. Ein Abstellen der Begasung in der mobilen Blasensäule führte zu einem rapiden Abfall der Bakterienaktivität. Zusammenfassend sind herkömmliche Animpfverfahren für die Essigsäurebakterien in der Essigfermentation nicht geeignet. Das Aufrechthalten des Sauerstoffeintrags ist erforderlich, um die Reproduzierbarkeit der Hauptkulturexperimente mit diesen Bakterien zu gewährleisten. Industriell wird Essig in Repeated-batch- oder Repeated-fed-batch-Verfahren hergestellt. Bisher gab es keine Kleinkultursysteme für Repeated-batch-Bioprozesse. Deshalb wurde ein neues geschütteltes Kultivierungssystem für die parallele Repeated-batch-Essigfermentation erforscht. Ein neuer Betriebsmodus – der „Flushing-repeated-Batch“ – wurde entwickelt. Die parallele Repeated-batch-Essigfermentation konnte automatisiert in geschüttelten Überlaufgefäßen mit nur einer Pumpe pro Reaktor etabliert werden. Das Flushing-repeated-batch-Verfahren wurde theoretisch betrachtet und realisiert. Die Ethanolkonzentration wurde während der Repeated-batch-Fermentation mit Halbleitergassensoren gemessen. Das Umstellen von einer Alkoholcharge auf andere Alkoholchargen resultierte in verlängerten Lag-Phasen und Dauern der ersten Batch-Zyklen. In den nachfolgenden Batch-Zyklen nahmen die Fermentationszeiten beachtlich ab. Diese Abnahme der entsprechenden Lag-Phasen deutet auf eine Adaptation der gemischten Essigsäurebakterienkultur an die spezifische Alkoholcharge hin. Folglich sind Flushing-repeated-batch-Fermentationen in kleinem Maßstab nützlich, um Fermentationsbedingungen zu screenen und Bioprozesse hinsichtlich der Robustheit, Stabilität und Produktivität zu verbessern. Zur Verbesserung des geschüttelten Repeated-batch-Systems wurde es mit elektrochemischen Sauerstoffsensoren ausgestattet. Die Messung des Sauerstoffpartialdrucks im Kopfraum der Reaktoren erlaubte die Kompensation der Sauerstoffpartialdruckabhängigkeit der Ethanolsensoren. Weiterhin konnte die Sauerstofftransferrate im Repeated-batch-Fermentationssystem während der Kultivierung bestimmt werden. Die Sauerstofftransferrate war mit 28 mmol/L/h in der gleichen Größenordnung wie bei der Batch-Kultivierung in der RAMOS-Anlage. Zur Online-Kalibrierung der Sauerstoffsensoren wurde eine Methode mittels Umstellen der Begasungsrate theoretisch betrachtet und praktisch implementiert. Nachdem die Essigfermentation im Millilitermaßstab in Schüttelkolben bewerkstelligt wurde, wurde sie auf den Mikrolitermaßstab in Mikrotiterplatten herunterskaliert. Um die Verdunstungsverluste von Ethanol und Essigsäure in einer Mikrotiterplatte während der Fermentation zu minimieren wurde ein maßgeschneiderter Deckel entwickelt. Für die Berechnung der Dimensionen eines Deckellochs, das eine ausreichende Belüftung und Sauerstoffversorgung garantiert, wurde ein Diffusionsmodell verwendet. Eine Referenzfermentation in einem 9 L-Bioreaktor diente der Auslegung geeigneter Kultivierungsbedingungen in der Mikrotiterplatte. Die minimalen Gelöstsauerstoffanteile in der Mikrotiterplatte lagen mit 7,5% bis 23% Luftsättigung in der gleichen Größenordnung wie im 9 L-Bioreaktor. Die Verdunstungsverluste von Ethanol und Essigsäure waren nach 47 h kleiner als 5% und damit im Vergleich zu einer Mikrotiterplattenfermentation mit einer gasdurchlässigen Folie deutlich reduziert. Die Kultivierungszeiten in der Mikrotiterplatte entsprachen mit 40 h der Kultivierungszeit im 9 L-Bioreaktor. Somit stellen Mikrotiterplattenkultivierungen mit dem maßgeschneiderten Deckel eine Plattform für Hochdurchsatzstudien an der Essigfermentation dar, die vergleichbare Ergebnisse zur Kultivierung im 9 L-Bioreaktor liefert.

In industry, vinegar is widely produced by submerged fermentation. Although vinegar production is established on the large scale, small scale culture methods, in which bioprocesses are typically developed or optimized nowadays, are missing. To reinvestigate the established fermentation process, the aim of this thesis was the development of suitable small scale culture methods and systems for submerged vinegar fermentation. Since obligatory aerobic acetic acid bacteria in vinegar production suffer even from short oxygen depletion during traditional precultivation steps, the reproducibility of results in the main culture is insufficient. A reproducible small scale cultivation method for obligatory aerobic acetic acid bacteria at industrially relevant high ethanol and acetic acid concentrations was established by ensuring constant oxygen transfer in the whole inoculation procedure. An acetic acid bacteria preculture was drained off from a laboratory-scale bioreactor into an aerated mobile bubble column and transferred to an already shaking RAMOS shake flask device. Whereas the respiration curves of the traditionally processed acetic acid bacteria cultures were low and greatly diverged, those of the preculture transferred first into the bubble column and then into the already shaking flasks were high and coincided with one another. Shutting off aeration in the mobile bubble column led to a rapid decrease in bacterial activity. In conclusion, traditional precultivation steps are not suitable for obligatory aerobic acetic acid bacteria in vinegar fermentation. Maintaining constant oxygen transfer is necessary to guarantee the reproducibility of main culture experiments with such bacteria. In industry, vinegar is produced in repeated batch or repeated fed-batch processes. As yet, there was no small scale culture system for repeated batch bioprocesses. Therefore, a new shaken culture system for parallel repeated batch vinegar fermentation was explored. A new operation mode – the flushing repeated batch – was developed. Parallel repeated batch vinegar fermentation could be established in shaken overflow vessels in an automated operation with only one pump per reactor. This flushing repeated batch was theoretically investigated and empirically tested. The ethanol concentration was monitored during repeated batch fermentation by semiconductor gas sensors. The switch from one ethanol substrate lot to different ethanol substrate lots resulted in prolonged lag phases and durations of the first batches. In the subsequent batches the length of the fermentations decreased considerably. This decrease in the respective lag phases indicates an adaptation of the acetic acid bacteria mixed culture to the specific ethanol substrate lot. Consequently, flushing repeated batch fermentations on small scale are valuable for screening fermentation conditions and, thereby, improving bioprocesses in terms of robustness, stability and productivity. To improve the shaken repeated batch system, the system was expanded with electrochemical oxygen sensors. The measurement of the oxygen partial pressure in the headspace of the shaken reactors allowed the compensation of the oxygen partial pressure dependency of the semiconductor ethanol gas sensors. Furthermore, the oxygen transfer rate in the repeated batch fermentation system could be determined during cultivation. The oxygen transfer rate was with 28 mmol/L/h in the same range as in batch cultivations in the RAMOS device. To calibrate the oxygen sensors online during cultivation, a method applying gas flow change was theoretically considered and practically implemented. After the vinegar fermentation was accomplished in milliliter shake flask scale in batch as well as repeated batch mode, the vinegar fermentation was scaled-down to microliter scale in microtiter plates of this thesis. In order to minimize evaporation losses of ethanol and acetic acid in a 48-well microtiter plate during vinegar fermentation a new custom-made lid was developed. A diffusion model was used to calculate the dimensions of a hole in the lid to guarantee a suitable oxygen supply and level of ventilation. A reference fermentation was conducted in a 9 L-bioreactor to enable the calculation of the proper cultivation conditions in the microtiter plate. The minimum dissolved oxygen tensions in the microtiter plate were between 7.5% and 23% of air saturation and in the same range as in the 9 L-bioreactor. Evaporation losses of ethanol and acetic acid were less than 5% after 47 h and considerably reduced compared to those of microtiter plate fermentations with a conventional gas-permeable seal. Furthermore, cultivation times in the microtiter plate were with about 40 h as long as in the 9 L-bioreactor. In conclusion, microtiter plate cultivations with the new custom-made lid provide a platform for high-throughput studies on vinegar fermentation. Results are comparable to those in the 9 L-bioreactor.

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