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Prozessnahe Hochdurchsatzoptimierung der heterologen Proteinproduktion in alternativen Wirtsorganismen = High-throughput optimization of heterologous protein production in alternative hosts
2012 & 2013
Zugl.: Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2012
Druckausgabe: 2012. - Onlineausgabe: 2013. - Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University.
Genehmigende Fakultät
Fak04
Hauptberichter/Gutachter
Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2012-09-27
Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-44161
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/210455/files/4416.pdf
Einrichtungen
Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Bioverfahrenstechnik (Genormte SW) ; Proteinsekretion (Genormte SW) ; Ingenieurwissenschaften (frei) ; Industrielle Biotechnologie (frei) ; Mikrobioreaktoren (frei) ; Bioprozessoptimierung (frei) ; industrial biotechnology (frei) ; microbioreactors (frei) ; bioprocess optimization (frei)
Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620
rvk: WF 9720 * WF 9725
Kurzfassung
In dieser Arbeit wird die Entwicklung automatisierter Hochdurchsatzmethoden zur Optimierung der heterologen Proteinproduktion beschrieben. Hierzu werden im ersten Teil der Arbeit die technischen Voraussetzungen geschaffen, indem eine automatisierte Kultivierungsplattform - dem Jülich Bioprocess Optimization System (JuBOS) - konzipiert und validiert wird. Die beiden Hauptinstrumente sind hierbei ein Mikrotiterplatten (MTP) - basiertes Kultivierungssystem und ein angebundener Pipettierroboter, durch den u.a. ein Flüssigkeitstransfer in und aus den einzelnen MTP-Kavitäten ermöglicht wird. Funktionale Erweiterungen des Systems durch weitere Instrumente ermöglichen auf dem JuBOS automatisierte mikrobielle Arbeiten wie z.B. Probenahme und Aktivitätsassays. Durch eine Maßstabsvergrößerung verschiedener MTP-Kultivierungen in Labor-Bioreaktoren (1 L, 20 L) wird die Validität der Ergebnisse nachgewiesen. In dem zweiten Teil der Arbeit werden auf dem JuBOS vier Methodenmodule zur beschleunigten Bioprozessentwicklung der heterologen Proteinproduktion entwickelt. Als Modellprotein wurde hierzu Cutinase aus Fusarium solani pisi verwendet, sekretorisch produziert mit Corynebacterium glutamicum. In dem ersten Methodenmodul werden aus einer Signalpeptid-Bibliothek durch ein automatisiertes Stammscreening die produktivsten Cutinase-Signalpeptid-Kombinationen identifiziert. Als bioverfahrenstechnische Optimierung wird mit der Methode des sogenannten Induction Profilings optimale Kombinationen von IPTG-Konzentration und Induktionszeitpunkt verschiedener Modellproteine untersucht. Neben einer Produktivitätssteigerung von 40% wird ebenfalls ein deutlicher Einfluss des Zielproteins selbst deutlich. Als weiterer Parameter wird das Minimalmediums CG XII hinsichtlich maximaler Proteinproduktion mit C. glutamicum optimiert. Durch ein Screening von 19 Medienkomponenten und einer Algorithmen-basierten Optimierung wird ein neues Minimalmedium entwickelt, mit dem die Ausbeute von zwei Zielproteinen um den Faktor 1.5 gesteigert wird. Als abschließende Methode zur Bioprozessoptimierung wird die Möglichkeit zur Miniaturisierung von Fed-Batch-Prozessen mit Hilfe eines enzymatischen Glucose-Release-Mediums untersucht. Hierdurch ist eine systematische Variation der linearen Feedrate bereits in Mikrotiterplatten möglich und die biomassespezifische Produktbildung um 100% gesteigert. Im einfachsten Fall einer Prozessoptimierung werden diese beschriebenen Methoden nacheinander abgearbeitet. Bei einer solchen Kette von Optimierungsschritten wird mit dem JuBOS der Durchsatz einer Bioprozessentwicklung um den Faktor 17 im Vergleich zu parallelen Bioreaktor-kultivierungen gesteigert.This work includes the development of automated high-throughput methods for optimizing heterologous protein production. In the first part of the work, the automated cultivation platform named “Jülich Bioprocess Optimization System” (JuBOS) is designed and validated. The two main parts are a microtiter plate (MTP)-based cultivation system and a pipetting robot platform. The robot enables fluid transfer in and out of the MTP wells during cultivation. Further instrument integrations enable automated microbial work on the JuBOS, like sample handling and enzyme activity assays. MTP cultivations of various protein producer strains are successfully scaled up to laboratory bioreactors with volumes of 1 L and 20 L showing the validity of the results. In the second part, four methods for enhancing bioprocess optimization have been developed and applied. Mostly cutinase from Fusarium solani pisi secreted with Corynebacterium glutamicum was used as recombinant model protein. In the first method an automated strain screening results in an appropriate selection of signal peptide/cutinase combinations with higher precision than hitherto screening methods. As first biochemical engineering parameter, optimal combinations of IPTG concentration and induction time are evaluated with the Induction Profiling. Besides an impact of the two parameters on the product yield, also the target protein itself influences the optimum. The third method of this work is the automated media optimization shown for CG XII minimal media optimized for protein production. A screening of 19 media components and a subsequent algorithm-based optimization leads to a new minimal medium, which increases the yield by factor 1.5. Furthermore, the possibility of miniaturization of fed-batch processes using an enzymatic glucose release medium is shown. In the simplest case, these optimization methods are carried out subsequently. In such a sequence, the throughput of a bioprocess optimization is enhanced by factor 17 compared to parallel bioreactor cultivations.
Fulltext: 
PDF
Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis
Format
online, print
Sprache
German
Interne Identnummern
RWTH-CONV-143603
Datensatz-ID: 210455
Beteiligte Länder
Germany
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