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A fundamental research of growth, metabolism and product formation of tobacco suspension cells at different scales = Eine grundlegende Untersuchung von Wachstum, Metabolismus und Produktbildung von Tabaksuspensionszellen in unterschiedlichen Maßstäben



Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von David Alexander Ullisch

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2012

UmfangXII, 135 Bl. : Ill., graph. Darst.


Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2012


Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter


Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2012-09-17

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-43014
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/65387/files/4301.pdf

Einrichtungen

  1. Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Tabak (Genormte SW) ; Zellkultur (Genormte SW) ; Biowissenschaften, Biologie (frei) ; Nicotiana tabacum (frei) ; Medienoptimierung (frei) ; RAMOS (frei) ; Sauerstofftransfer (frei) ; Schüttelkolben (frei) ; nicotiana tabacum (frei) ; media optimization (frei) ; oxygen transfer rate (frei) ; shake flasks (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Seit mehr als zwanzig Jahren spielen Pflanzenzellkulturen (PZK) eine große Rolle bei der Expression von rekombinanten Proteinen wie Hormonen, Wachstumsfaktoren, Antikörpern und Antigenen. Bisher lagern alleine mehr als 700 verschiedene Arten von PZK in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig. Die Tabakzelllinie Nicotiana tabacum BY-2 spielt hier eine besondere Rolle, da sie als Modelorganismus für die Untersuchung von PZK dient. Zur Charakterisierung dieser Zelllinie wurden in bisherigen Studien oft nur ein oder zwei Wachstumsparameter (Biomasse, Leitfähigkeit, oder Osmolalität) herangezogen. Folglich kann man nur einen eingeschränkten Einblick in den Stoffwechsel der PZK bekommen. Ein erstes Ziel dieser Arbeit ist die Identifikation der optimalen Wachstumsbedingungen in Schüttelkolben sowie eine umfassende Charakterisierung einer transgenen Tabakzelllinie. Für diese Charakterisierung wurde online die Sauerstofftransferrate dieser Zelllinie mit Hilfe des Respiration Activity MOnitoring System (RAMOS) und überdies eine Vielzahl verschiedener Wachstumsparamter offline bestimmt. Eine höhere Schüttelfrequenz resultierte in höheren Sauerstofftransferraten und in einem schnelleren Wachstum. Darüber hinaus konnte online der Verbrauch von Ammonium im Medium anhand der Sauerstofftransferrate abgeleitet werden. Das MS-medium das bevorzugte Medium für die Kultivierung von Tabaksuspensionszellen. Basierend auf einer umfassenden Analyse des MS-Mediums sowie Zusammenhängen zwischen Wachstum und rekombinanter Proteinexpression wurde das MS-Medium gezielt optimiert. In dieser Arbeit dienten die Fluoreszenzproteine GFP und YFP als Modelproteine. Es wurde gezeigt, dass die Anfangskonzentration von Ammonium einen signifikanten Einfluss auf das Zellwachstum und die Proteinsynthese hat. Nach einer gezielten Optimierung des MS-Mediums konnte die Menge des Zielproteins verdoppelt werden. Das optimierte MS-Medium zeigte auch bei einer anderen transgenen Tabakzelllinie (NT-1) den gewünschten Effekt und verdoppelte die Endkonzentration des therapeutisch wichtigen Proteins Hämaggluthinin A (HA) des Vogelgrippevirus. Eine Routinemethode zur Handhabung von PZK ist die sogenannte Subkultivierung bei der durchwachsene Zellkultur in frisches Medium pipettiert wird. Allerdings kommt es bei Anwendung dieser Methode zu undefinierten Animpfbedingungen. Aus diesem Grund werden zur Produktion von rekombinanten Proteinen tierische Zellkulturen bevorzugt, da für diese bereits ein Zellbanksystem etabliert ist. Darüber hinaus spielt die genetische Instabilität von transgenen PZK eine große Rolle, denn es kommt häufig zu einer inkonsistenten Expression des Zielproteins. Dieses bekannte Problem wurde bislang kaum dokumentiert. In dieser Arbeit wurde diese Variabilität im Wachstum anhand von insgesamt 22 Sauerstofftransferraten aus einem Zeitraum von über 2 Jahren dargestellt. Mit Hilfe einer neuen Methode der Subkultivierung konnten reproduzierbarere Ergebnisse erzielt werden. Die Produktivität sank in diesem Zeitraum um ca. 80%. Außer in Schüttelkolben wurden PZK auch in Mikrotiterplatten (MTP) sowie in Rührkesselreaktoren kultiviert. In dieser Arbeit wurde ein Scale-up, basierend auf einem gleichen volumetrischen Leistungseintrag durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass die steigende Viskosität ein Schlüsselparameter für das Wachstum im Fermenter darstellt. In MTP wurde die Expression von GFP das erste Mal online mit Hilfe des BioLectors gemessen. Es wurde gezeigt, dass das optimierte MS-Medium auch zu einem höheren GFP-Signal in MTP geführt hat. Die vorliegende Arbeit liefert einen tiefen Einblick in den Stoffwechsel und die Kultivierung von Tabaksupensionszellen in Schüttelkolben, Rührkesselreaktoren und MTP. Durch eine Kombination aus dem online Signal der Sauerstofftransferrate und mit Hilfe einer Vielzahl verschiedener Offlineparamter konnte das MS-Medium gezielt optimiert werden und die Ausbeute des Zielproteins letztendlich verdoppelt werden. Mit Hilfe der RAMOS-Technologie ist es möglich die Sauerstofftransferrate von PZK online zu messen. Damit ist sie ein wichtiges analytisches Werkzeug bei der Untersuchung weiterer Zelllinien und deren Optimierung von Kultivierungsbedingungen.

For over two decades, plant cell cultures have been promising hosts for the expression of recombinant proteins such as hormones, growth factors, full-size antibodies and antigens. So far, over 700 different plant cell cultures are stored in the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) in Braunschweig. Among these plant cell cultures, the tobacco cell line Nicotiana tabacum Bright Yellow 2 (BY-2) was chosen as a good host cell line for the production of recombinant proteins, as this cell line is well characterized – showing high growth rates and high cell synchrony. Up to now, individual studies have only handled one or two parameters (i.e. biomass, osmolality or conductivity) for studying BY-2 cell growth. Such limited studies, however, do not provide a comprehensive insight into BY-2 cell metabolism. A first objective of this thesis, is to identify the optimal growth conditions for tobacco suspension cultures in shake flasks and to comprehensively characterize the growth of a transgenic BY-2 cell line. Hereby, multiple growth parameters were analyzed offline and online by using a Respiration Activity MOnitoring System (RAMOS). A faster shaking frequency resulted in clearly higher oxygen transfer rates and biomass concentrations. Moreover, a reproducibly observed shift of the oxygen transfer rate (OTR) could be identified to indicate ammonium depletion in the medium. Today, the MS-medium is the preferred medium for the cultivation of tobacco suspension cells, even though it was formulated for an optimal growth and not for the production of recombinant proteins. Here, the fluorescent proteins GFP and YFP are used as model proteins and their expression was elucidated in detail. Based on the correlations between nutrient consumption, cell growth and product formation, it is the intention to improve the standard MS-medium to enhance the expression of the recombinant proteins. The initial ammonium concentration was found to have significant influence on either cell growth and played a pregnant role in protein synthesis. After the MS-medium was improved, the GFP concentration nearly doubled. When this improved ammonium enriched medium was applied to another transgenic tobacco cell line similar improvements to the amount of the glycoprotein influenza hemagglutinin (HA) produced by Nicotiana tabacum NT-1 cells could be achieved. Furthermore, a controlled-release system was successfully applied to plant suspension cultures. Using this controlled-release system where additional ammonium was supplied to the plant cells, an increase of 40% GFP intensity was observed. Plant cells are maintained in suspension by pipetting a certain volume of grown culture into fresh medium. Applying this subcultivation method, results in non-defined growth conditions of plant cells. Due to that problem, plant suspension cultures always have to compete with animal cultures for the production of therapeutically relevant proteins as they have the advantage of an established cell banking system. Moreover, researchers are facing the huge problem of genetic instability of plant cells where growth and recombinant protein production tremendously vary. This well-known problem has been poorly documented so far. This growth variability of plant suspension cells was identified by relating the measured values of 22 oxygen transfer rates in a period of over two years. After the implementation of a new subculturing method a significantly better reproducibility of plant cell growth was obtained. However, the productivity, detected by fluorescence and Western blot, decreased by 80% in the same period. Besides the cultivation of plant cells in shake flasks, in this work, plant suspension cells were also cultivated in stirred tank reactors and microtiter plates (MTPs). As there are no geometric similarities between shake flasks and stirred tank reactors, a scale-up is not a trivial process. Here, the scale-up was carried out under the assumption of a constant volumetric power input. It could be shown, that an increasing viscosity was the key parameter influencing cell growth in the fermenter. According to literature there is only one publication dealing with plant cell cultivation in small scale. In this thesis BY-2 cell growth as well as GFP expression was monitored online using the BioLector technology. In addition, it was demonstrated that medium modifications influenced plant cell growth and the GFP production in the same way as shown in shake flasks. Ultimately, this thesis provides a deep insight into tobacco cultivations in shake flasks, fermenters and MTPs. The combined offline and online analysis of tobacco suspension cultures was used for a detailed growth characterization and media optimization to improve growth and boost target product formation. In conclusion, the RAMOS technology allows the online analysis of oxygen consumption and has been proven to be a useful analytical tool investigating plant suspension cultures.

Fulltext:
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Dokumenttyp
Dissertation / PhD Thesis

Format
online, print

Sprache
English

Interne Identnummern
RWTH-CONV-126646
Datensatz-ID: 65387

Beteiligte Länder
Germany

 GO


OpenAccess

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The record appears in these collections:
Document types > Theses > Ph.D. Theses
Faculty of Mechanical Engineering (Fac.4)
Publication server / Open Access
Public records
Publications database
416510

 Record created 2013-01-28, last modified 2022-04-22


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