Online monitoring in continuously shaken microtiter plates for scalable upstream bioprocessing

Kensy, Frank Torsten; Büchs, Jochen

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-34765

Online monitoring in continuously shaken microtiter plates for scalable upstream bioprocessing = Online-Monitoring in kontinuierlich geschüttelten Mikrotiterplatten für skalierbare Ergebnisse in der Fermentationsentwicklung

Kensy, Frank Torsten (Author)

2011

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Frank Torsten Kensy

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2011

UmfangXIV, 143 S. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2010

Genehmigende Fakultät
Fak04

Hauptberichter/Gutachter
Büchs, Jochen (Thesis advisor)

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2010-06-16

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-34765
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/63263/files/3476.pdf

Einrichtungen

Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik (416510)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Bioreaktor (Genormte SW) ; Online-Messung (Genormte SW) ; Fermentation (Genormte SW) ; High throughput screening (Genormte SW) ; Maßstabübertragung (Genormte SW) ; Mikroreaktor (Genormte SW) ; Zellkultur (Genormte SW) ; Ingenieurwissenschaften (frei) ; Mikrobioreaktor (frei) ; Hochdurchsatz-Fermentation (frei) ; high-throughput-fermentation (frei) ; microbioreactor (frei) ; microfermenter (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 620

Kurzfassung
Diese Dissertation untersucht die Anwendungsmöglichkeiten von Mikrotiterplatten als Hochdurchsatz-Experimentierplattform in der Bioprozeßentwicklung. Zu diesem Zwecke wurden drei grundlegende Aspekte der Fermentation in dieser Arbeit studiert: 1) Charakterisierung von Stofftransfer-Bedingungen in Mikrotiterplatten (MTPs), 2) Entwicklung einer neuen Online-Meßtechnik zur Detektion relevanter Fermentationsparameter, 3) Überprüfung der Skalierbarkeit von Mikrotiterplatten auf Rührkessel-Fermenter. Der Sauerstofftransfer in Mikrotiterplatten wurde mit Hilfe der Sulfit-Oxidationsmethode in 24-, 48- and 96-Well MTPs ausführlich charakterisiert. Einerseits stellte sich dabei heraus, dass die erreichten Sauerstofftransfer-Kapazitäten (OTRmax) von 0,039 and 0,052 mol/L/h (kLa= 250 and 300 1/h) für runde 24- und 96-Well MTPs für die meisten mikrobiellen Fermentationen limitierend sein können. Andererseits zeigten runde 48-Well MTPs sehr hohe OTRmax-Werte von 0,28 mol/L/h (kLa= 1600 1/h), jedoch mit dem Nachteil, dass diese hohen Stofftransferwerte nur bei sehr hohen Schüttelfrequenzen (1400 1/h) und sehr kleinen Füllvolumina (300µL) erreichbar waren. Bei diesen Bedingungen fällt das Online-Monitoring in den Wells der MTP und die Probennahme für Offline-Analytik schwer. Daher wurde auch die neu entwickelte 48-Well Flowerplate eingesetzt. Die Sauerstofftransfer-Kapazität (OTRmax) konnte auf 0,14 mol/L/h (kLa= 800 1/h) bei akzeptablen Füllvolumina (500 µL) bestimmt werden. Zudem ist das Online-Monitoring und die Probennahme aus den Wells bei diesen Bedingungen möglich. Des Weiteren wurde eine neue Online-Meßtechnik für die Detektion aller relevanter Fermentationsparameter wie Biomasse- und Proteinkonzentration von fluoreszierenden Proteinen sowie pH und pO2 mit Hilfe der Optoden-Technologie entwickelt. Diese mittlerweile unter dem Markennamen “BioLector” kommerzialisierte Technologie detektiert die genannten Parameter online in allen Wells einer Mikrotiterplatte während des kontinuierlichen Schüttelvorgangs eines Rotationsschüttlers. Die neue Technik wurde anhand von verschiedenen mikrobiellen Fermentationen mit dem Bakterium Eschericha coli und der Hefe Hansenula polymorpha validiert. Es konnte eine sehr weite lineare Korrelation zwischen Biomassetrockensubstanz (bis zu 50 g/L) und dem online detektierten Streulicht für Bakterien und Hefen aufzeigt werden. Die Skalierbarkeit zwischen Mikrotiterplatten- und Rührkessel-Fermentationen konnte für Eschericha coli und Hansenula polymorpha bewiesen werden. Der Vergleich von Mikrotiterplatten-Fermentationen mit 200 µL und Rührkessel-Fermentationen mit 1,4 L zeigten die gleiche Fermentationskinetik und –zeiten sowie gleiche absolute Konzentrationen für Biomasse und exprimiertes Protein (hier das Model-Protein: Green Fluorescent Protein) in beiden Maßstäben. Die Kombination der neuen Online-Meßtechnik mit der erst kürzlich entwickelten Flowerplate zeigte abschließend die großen Anwendungsmöglichkeiten in der Bioprozeßentwicklung. Die Technologie erfüllt alle Anforderungen an einen idealen Mikrobioreaktor: Hochdurchsatz, hohe Prozeß-Information und Skalierbarkeit auf Standard-Rührkessel-Fermenter. Die Anwendung dieser neuen Technology in der Bioprozeßentwicklung verspricht eine drastische Vereinfachung und Beschleunigung der Stammselektion und der Fermentationsentwicklung durch die Generierung von mehr relevanten Bioprozeß-Informationen im Mikromaßstab.

This thesis is focusing on the applicability of microtiter plates as platform for high-throughput experimentation in bioprocess development. Therefore, three main aspects have been studied in this thesis: 1) characterization of mass transfer in microtiter plates (MTPs), 2) development of a new online-monitoring technique for detecting the most relevant fermentation parameters, 3) proof of scalabilty from microtiter plates to stirred tank fermenters. The oxygen mass transfer into microtiter plates was characterized with the sulfite oxidation method in 24-, 48- and 96-well MTPs. On the one hand, the results pointed out that the achieved maximum oxygen transfer capacities (OTRmax) of 0.039 and 0.052 mol/L/h (kLa= 250 and 300 1/h) for round 24- and 96-well MTPs could be limiting for most of microbial fermentations. On the other hand, round 48-well MTPs provided very high OTRmax up to 0.28 mol/L/h (kLa= 1600 1/h) with the drawback that these high values could only be achieved at very high shaking frequencies (1400 1/min) and very small filling volumes (300 µL) which were not very suitable for online monitoring in the microwells and for further offline sample analysis. Therefore, also the 48-well Flowerplate was characterized in oxygen mass transfer resulting in high OTRmax values of 0.14 mol/L/h (kLa= 800 1/h) at acceptable filling volumes (500 µL) for online detection and further offline sample analysis. Furthermore, a new online monitoring technique for the online detection of all relevant fermentation parameters such as biomass and fluorescent protein concentrations as well as pH and dissolved oxygen tension (DOT) by optodes in continuously shaken MTPs - in the meantime commercialized under the trade name BioLector - was developed and validated. This technique was approved in several examples of microbial fermentations with Eschericha coli and the yeast Hansenula polymorpha as model organisms. It could be demonstrated that online biomass detection is possible up to biomass concentrations of 50 g/L cell dry weight due to a linear correlation between scattered light intensities and cell dry weight in the mentioned range. The scalability of microtiter plate fermentations to standard stirred tank fermenters was proven with Eschericha coli and the yeast Hansenula polymorpha. A comparison of fermentations in 200 µL in MTPs with fermentations in 1.4 L stirred tank fermenter depicted the same fermentation kinetics and fermentation times as well as absolute concentrations proved by online biomass and protein expression of green fluorescent protein (GFP) as model protein in both scales. The combination of the online monitoring technique with the recently developed Flowerplate finally demonstrated the broad applicability of this technology in upstream bioprocessing providing all relevant fermentation parameters online at elevated oxygen transfer conditions. This technology fulfills all requirements of an ideal microbioreactor system by featuring high-throughput, high information content and scalability to standard stirred tank fermenters. The application of this new technology in bioprocess R&D could dramatically facilitate and accelerate clone screening and fermentation development by providing more relevant bioprocess information at microscale.

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