Establishment of a systematised approach for the development of novel diagnostics and therapeutics in the field of biotechnology

Schumacher, Petra; Fischer, Rainer

doi:urn:nbn:de:hbz:82-opus-15499

Establishment of a systematised approach for the development of novel diagnostics and therapeutics in the field of biotechnology = Etablierung eines systematischen Verfahrens zur Entwicklung neuer Diagnostika und Therapeutika im Bereich der Biotechnologie

Schumacher, Petra (Author)

2006

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Petra Schumacher

ImpressumAachen : Publikationsserver der RWTH Aachen University 2006

UmfangIII, 123 Bl. : Ill., graph. Darst.

Aachen, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Fischer, Rainer (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2006-06-26

Online
URN: urn:nbn:de:hbz:82-opus-15499
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/61096/files/Schumacher_Petra.pdf

Einrichtungen

Fakultät für Mathematik, Informatik und Naturwissenschaften (100000)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Biowissenschaften, Biologie (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Das Ziel des ersten Teils der Arbeit war die Generierung eines Antikörpers gegen Nonylphenol, um diesen später in Biofiltern zur Eliminierung von Nonylphenol aus dem Abwasser einzusetzen. Dazu wurden Mäuse verschiedenen Strategien folgend immunisiert. Hier führte die „High Zone Tolerisation“ zu den besten Nonylphenol-spezifischen Antikörper-Titern im Serum. Anschließend wurden die murinen B-Zellen erfolgreich mit Myelomzellen fusioniert und im Folgenden als Einzelzellen sortiert (FACS). Vier der daraus resultierenden stabilen monoklonalen Zelllinien zeigten spezifische Bindungsaktivität an Nonylphenol im ELISA. Der Antikörper NP78 wurde weiterhin in einem „Ligand fishing“ Versuch mit anschließender GCMS Analyse des Überstandes getestet, wodurch ebenfalls die Nonylphenol-Bindung bewiesen werden konnte. Das Ziel des zweiten Teils war die Etablierung eines Verfahrens zur Generierung von Antikörpern spezifisch für Lungenkrebs- bzw. Pankreaskrebs-Proteine und der anschließenden Identifizierung dieser Proteine. Dieses Verfahren wurde entwickelt um die Basis eines Hochdurchsatz-Verfahrens zur Proteom weiten Produktion monoklonaler Antikörper, mit potentiellem diagnostischem oder therapeutischem Wert, zu bilden. Hierzu wurden Mäuse mit ganzen Zellen, Zelllysaten sowie Gewebelysaten immunisiert. Die Entwicklung des Antigen-spezifischen Serumtiters konnte im ELISA für alle Antigene gezeigt werden. Die murinen B-Zellen wurden mit Sp2/mIL-6 Myelom Zellen fusioniert. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Einzelzellablage der Hybridomzellen (FACS) mit anschließender Kultivierung der Einzelzellen mit Wachstumsraten bis zu 40% etabliert werden. So wurden 394 und 340 (F. Kampmeier) Antikörper produzierende Hybridomzellen etabliert. Nur wenige dieser Klone konnten aufgrund von Limitierung der Arbeitskraft, Zeit und Finanzen analysiert werden. Die Antikörperproduktion fand in proteinfreiem Medium statt. In Kombination mit Affinität-Matrix-Beads konnten so aufwendige Aufreinigungsschritte vermieden werden. Die Antikörper wurden zur Immunopräzipitation und anschließender Identifizierung der Antigene mittels Massenspektrometrie genutzt. Die Funktionalität des Verfahrens konnte durch ein Modell-System bewiesen werden, in dem Antikörper bekannter Spezifität und mit dem entsprechenden Antigen versetztes Zelllysat verwendet wurden. Fünf neue Antigene konnten mittels dieser Methode identifiziert werden. Die Ergebnisse bestätigen die Eignung des Verfahrens zur Produktion und Charakterisierung von Antikörpern gegen eine Vielzahl von Antigenen.

The aim of the first part of this thesis was to generate an antibody against Nonylphenol for later use in biofilters for the elimination of Nonylphenol from waste water. For this purpose mice were immunised following different strategies. The immunisation according to High Zone Tolerisation led to the best results regarding a nonylphenol specific antibody titre in the mouse serum. Successful fusion of the murine B-cells with myeloma cells were performed followed by single cell sorting (FACS). Monoclonal clones could be established and at least 4 stable cell lines showed specific binding to Nonylphenol in ELISA. One antibody was further tested in a ligand fishing approach with subsequent GCMS analysis of the supernatant which proved the binding to NP. The aim of the second part was the establishment of a procedure for the generation of antibodies specific for proteins of lung cancer and pancreatic cancer, respectively, and subsequent identification of these proteins. The approach was designed to prepare the ground for the establishment of a high throughput setup for the proteome wide production of monoclonal antibodies, focusing on the discovery of a compilation of targets with potential diagnostic or therapeutic value. Mice were immunised with whole cells, cell lysates as well as tissue lysates. The development of a specific antibody titre could be proven by ELISA for all antigens. Mouse spleen cells were fused with Sp2/mIL-6 myeloma cells. In the scope of this project the single cell sorting of hybridoma cells could be established followed by the successful culturing of single cells resulting in growth rate of up to 40%. By this 394 and 340 (F. Kampmeier) antibody producing clones were obtained. Only a part of these clones could be analysed due to time and manpower limitations. For antibody production a protein free medium was used. In combination with affinity matrix beads the need of time and money consuming purification steps is circumvented. The antibodies were used for immunoprecipitation experiments and subsequent identification of the antigens by mass spectrometry. The functionality of this approach could be proven by model systems using antibodies of known specificity with lysate spiked with the appropriate antigen. Five new antigens could be identified by this method. The presented results confirm the suitability of the approach for the production and characterisation of antibodies against a variety of targets.

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