Dokument: Charakterisierung und Anwendung funktioneller neuronaler Netzwerke generiert aus murinen embryonalen Stammzellen.

Titel:	Charakterisierung und Anwendung funktioneller neuronaler Netzwerke generiert aus murinen embryonalen Stammzellen.
Weiterer Titel:	Characterisation and application of functional embryonic stem cell-derived neuronal networks
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=13992
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20100226-084219-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. rer. nat. Illes, Sebastian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,51 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.02.2010 / geändert 24.02.2010
Beitragende:	Prof. Dr. Müller, Hans Werner [Gutachter] Prof. Dr. Rose, Christine [Gutachter]
Stichwörter:	embryonale Stammzellen, neurale Stammzellen, neurale Differenzierung, neuronale Netzwerke, GABA, Glutamat, Liqour, Neurone, Elektrophysiologie, Neurogenese, Niche
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass ES Zell-abgeleitete neurale Zellen auf Multielektroden-Arrays (MEAs) kultiviert werden können und funktionelle neuronale Netzwerke bilden. Die elektrophysiologische Entwicklung ES Zell-abgeleiteter funktioneller Netzwerke wurde über eine nicht-invasive Messmethode beschrieben und erlaubte die Kategorisierung in vier elektrophysiologische Stadien. Parallele immunzytochemische und pharmakologische Analysen zeigten zum einen, dass die elektrophysiologische Reifung begleitet wird durch Neuritenwachstum und Synaptogenese, und zum anderen, dass die funktionellen neuronalen Populationen vorwiegend aus GABAergen und glutamatergen Neuronen bestehen. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden optimierte neurale Differenzierungsprozeduren an ES Zellen angewandt, welche es ermöglichten, neurale Kulturen herzustellen, die frei von restlichen ES Zellen sind und daher als reine neurale Kulturen für die Generierung neuronaler Netzwerke genutzt werden konnten. Zum einen konnte eine neurale Kultur gewonnen werden, welche sich aus unreifen, als auch aus reifen neuralen Zellen zusammensetzte und daher als heterogene neurale Zellpopulation bezeichnet wurde. Zum anderen ließ sich eine Zellpopulation generieren, die ausschließlich aus radialen Gliazell-ähnlichen Stammzellen bestand und daher als eine homogene neurale Zellpopulation angesehen werden konnte. Es zeigte sich aber, dass trotz einer quantitativ ausreichenden neuronalen und glialen Differenzierung, diese homogenen Kulturen keine funktionellen neuronalen Netzwerke in vitro bilden können. Demgegenüber erfolgte in den heterogenen neuralen Kulturen nicht nur eine terminale neuronale Differenzierung, sondern auch die Ausbildung eines funktionellen neuronalen Netzwerkes. Somit zeigte sich, dass die neurale Homogenität ES Zell-abgeleiteter neuraler Stammzellen eine verminderte terminale neuronale Differenzierung und Funktionalität zur Folge hat. Demgegenüber ist eine heterogene neurale Kultur für eine terminale neuronale Reifung, sowie auch der Ausbildung eines funktionellen neuronalen Netzwerkes förderlich. Daher lassen sich ES Zell-abgeleitete heterogene neurale Kultur reproduzierbare für die Generierung von neuronalen Netzwerken nutzen. In dem dritten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich sowohl primäre als auch ES Zell-abgeleitete neuronale Kulturen verwenden lassen, um die funktionellen Auswirkungen physiologischer und pathologisch-veränderter humaner Liqoures auf neuronale Netzwerke zu charakterisieren. So führte die Applikation physiologisch zusammengesetzter Liquores, welche von Patienten entnommen wurden, die keine akut neurologischen Erkrankungen aufwiesen, zu einer Erhöhung der neuronalen Aktivität und Synchronizität, der wahrscheinlich eine Inhibition GABAerger Transmission zugrunde liegt. Im Gegensatz dazu, erfolgte nach Applikation von pathologisch veränderten Liquores, gewonnen von Schädel-Hirn-Trauma (SHT)-Patienten, ein Zusammenbruch der neuronalen Netzwerkaktivität. Bezüglich der Wirkung pathologischer Liquores auf funktionelle neuronale Netzwerke lassen die Ergebnisse der Fraktionierungen und chemischen Analysen der Liquorproben, so wie auch die, der pharmakologischen Experimente, eine mögliche Schlussfolgerung zu. Dieser zu Folge verursacht eine SHT-bedingte Konzentrationserhöhung exzitatorisch wirkender Aminosäuren in Liquores eine NMDA-Rezeptor Überaktivierung, welche letztendlich zu einer Suppression neuronaler Netzwerkaktivität führt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass ES Zell-abgeleitete neurale Populationen zum Studium entwicklungsbiologischer, System-neurophysiologischer und auch zur Untersuchung klinischer Fragestellungen geeignet sind und damit ein neues Anwendungsgebiet in der klinischen Neurologie erschließen können. The present work demonstrates that embryonic stem (ES) cell-derived neural cells can be cultivated on multielectrode arrays (MEAs) and give rise to a functional neuronal network in vitro. With the help of this non-invasive method, the electrophysiological development could be described and categorized in four distinct developmental stages. The electrophysiological maturation is accompanied by neurite growth and synaptogenesis of the neuronal population, which contains predominantly GABAergic and glutamatergic neurons, demonstrated by pharmacological and immunocytochemical analyses performed in parallel. A further part of this work introduces different neural differentiation procedures that help obtaining an ES cell-derived neural culture, which is free from residual ES cells and thus represents an optimized and pure neural culture for the generation of functional neuronal networks in vitro. On the one hand a neural culture, termed heterogeneous neural cell population, could be generated. This one contained immature and mature neural cells. On the other hand a pure neural stem cell population, termed homogeneous neural cell population, could be generated, comprising only radial glia-like stem cells. In addition, it could be demonstrated, that the homogeneous neural cells give rise to an adequate number of neurons and astrocytes, but these neurons were not able to generate a functional neuronal network, due to an impaired terminal neuronal maturation in vitro. In opposite, the heterogeneous neural culture-derived neurons were able to proceed neuronal maturation and generate a functional neuronal network in vitro. Thus, homogeneity of ES cell-derived neural stem cells is accompanied by impaired terminal neuronal maturation and impaired neuronal functionality. The present results suggest that neuronal development or maturation in a heterogeneous neural cell population is required for the generation of functional neuronal networks from ES cell-derived neural cells. The third part of this study describes that both primary and ES cell-derived neuronal cells can be used for characterization of the neuronal network activity after application of physiological or pathologically altered human cerebrospinal fluid (CSF). It could be demonstrated that CSF from healthy patients – who showed no acute neurological diseases – induced an increase of the neuronal activity and synchrony, assumedly due to an inhibition of the GABAergic neurotransmission. In contrast, application of CSF from patients, who had suffered from a traumatic brain injury, resulted in a decrease of the neuronal activity and a collapse of the synchronous activity. The results of the fractionation and chemical analyses, in combination with pharmacological analyses of CSF probes allowed a possible explanation of the pathological CSF-mediated neuronal network activity collapse. We assume that an increase of the concentration of excitatory amino acids in the CSF, mediated by a traumatic brain injury, could cause an over activation of the NMDA-receptors, which finally leads to a suppression of the neuronal network activity. These results demonstrate direct functional consequences of a pathological alterations of humane CSF on neuronal network activity. This PhD thesis demonstrates that ES cell-derived neuronal networks can be generated and used to reveal developmental, system-neurophysiological and clinically important issues and therefore represents a new application of embryonic stem cells.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	26.02.2010
Dateien geändert am:	24.02.2010
Promotionsantrag am:	15.10.2009
Datum der Promotion:	09.12.2009