Dokument: Der Latrophilin-ähnliche Rezeptor HC110-R aus Haemonchus contortus: Charakterisierung von Rezeptor-Liganden-Interaktionen

Titel:	Der Latrophilin-ähnliche Rezeptor HC110-R aus Haemonchus contortus: Charakterisierung von Rezeptor-Liganden-Interaktionen
Weiterer Titel:	The Latrophilin-like Receptor HC110-R from Haemonchus contortus: Characterization of Receptor-Ligand-Interactions
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=6429
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20071128-095726-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Mühlfeld, Stefanie [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,97 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 27.11.2007 / geändert 27.11.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Wunderlich, Frank [Gutachter] PD Dr. Dr. Harder, Achim [Gutachter]
Stichwörter:	HC110-R, Latrophilin, Emodepside, alpha-Latrotoxin, Neuropeptid, Haemonchus contortus, C. elegans
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der 110 kDa große, Latrophilin-ähnliche Orphanrezeptor HC110-R, aus der Familie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, wurde in Haemonchus contortus als Target des neuen Anthelminthikums Emodepsid identifiziert (Saeger et al., 2001). Die Funktion der Latrophiline bzw. Latrophilin-ähnlichen Rezeptoren sowie deren native Liganden sind bisher nicht bekannt. Im Vordergrund dieser Arbeit stand deshalb die Identifizierung potentieller, natürlicher Liganden des Rezeptors HC110-R. Mit Hilfe der Oberflächenplasmonresonanz (SPR)-Technologie gelang es ein in vitro-System zur Analyse potentieller Interaktionspartner der extrazellulären, aminoterminalen Region von HC110-R zu etablieren. Es konnte gezeigt werden, dass Neuropeptide aus Nematoden potentielle Liganden des Rezeptors darstellen. Die Neuropeptide AF1, AF2, AF4, AF10, AF11, AF12, AF19, PF1, PF2 und PF3 aus C. elegans binden mit unterschiedlichen Eigenschaften, spezifisch an ein rekombinantes Protein, das die extrazelluläre Region des Rezeptors umfasst. Bestätigt werden diese Ergebnisse von Vorhersagen über genetische Interaktionen in C. elegans (Zhong und Sternberg, 2006). Zudem gelang es für die Neuropeptide AF1, AF2, AF10, PF2 und PF3 die Dissoziationsratenkonstante kd der Bindungen zu ermitteln. Diese lag in allen Fällen in einem engen Rahmen zwischen 0,01 und 0,05 s-1 und beschreibt schnelle Dissoziationen. Ferner konnte für die Peptide AF1, AF10 und PF2 die Affinität der Interaktion mittels der Gleichgewichtsdissoziationskonstante KD bestimmt werden. Es ergab sich für AF1 ein KD-Wert von 11 µM, für AF10 ein KD-Wert von 52 µM und für PF2 ein KD-Wert von 530 µM. Weiterhin gelang es ein System zur funktionellen Analyse potentieller Liganden zu etablieren. Verwendet wurde eine stabil transfizierte HEK-293-Zelllinie, die den gesamten Rezeptor exprimiert. In der Vergangenheit konnte das Neurotoxin alpha-Latrotoxin als artifizieller Agonist von HC110-R identifiziert werden. Fluoreszenzspektroskopische Messungen mit dem Ca2+-bindenden Indikator Fura-2 zeigten, dass alpha-Latrotoxin spezifisch eine HC110-R-vermittelte Erhöhung der [Ca2+]i von 219±14 nM induziert. Untersuchungen der HC110-R-bindenden Neuropeptide ergaben jedoch, dass unter diesen Bedingungen keines der Neuropeptide eine HC110-R vermittelte Erhöhung der [Ca2+]i stimuliert. Des Weiteren konnte nachgewiesen werden, dass keines der Neuropeptide eine modulierende Wirkung auf die alpha-Latrotoxin-stimulierte, HC110-R-vermittelte Erhöhung der [Ca2+]i hat. Es handelt sich somit nicht um Antagonisten. Im Rahmen dieser Arbeit wurden ferner unterschiedliche ‚Screening’-Verfahren mit der löslichen Fraktion eines Proteinextraktes aus C. elegans durchgeführt. Es gelang in 2D-Bindungsexperimenten an Nitrozellulosemembranen potentielle Interaktionspartner der aminoterminalen Region von HC110-R zu detektieren. Massenspektrometrisch konnte das Hitzeschockprotein Daf-21, ein zu dem humanen Hsp90 orthologes Protein, identifiziert werden. Diese Bindung konnte mit rekombinantem Daf-21 mit Hilfe der SPR-Technologie an einem 54 kDa großen, NH2-terminalen Fragment des Rezeptors HC110-R in vitro bestätigt werden. Vorhersagen über genetische Interaktionen in C. elegans ergaben, dass Daf-21 wahrscheinlich mit einem weiteren alpha-Latrotoxin-bindenden Protein, der Protein-Tyrosin Phosphatase-3 (PTP-3) interagiert (Zhong und Sternberg, 2006). The 110 kDa Latrophilin-like orphan receptor HC110-R from Haemonchus contortus belongs to the family of G-Protein coupled receptors and was first identified as a target for the new anthelmintic drug Emodepside (Saeger et al., 2001). Both function and natural ligands of latrophilin family members are unknown to date. This study was aimed at identifying putative natural ligands of the receptor HC110-R. Using surface plasmon resonance (SPR)-technology, an in vitro system for the analysis of the interaction of potential ligands with the extracellular HC110-R aminoterminal region was established. This study shows that neuropeptides of nematodes are potential ligands of HC110-R. Neuropeptides AF1, AF2, AF4, AF10, AF11, AF12, AF19, PF1, PF2 and PF3 from C. elegans bound specifically to a recombinant polypeptide comprising the extracellular aminoterminal region of the receptor. Genome-wide predictions of C. elegans genetic interactions confirmed these findings (Zhong and Sternberg, 2006). Interaction of the neuropeptides AF1, AF2, AF10, PF2 and PF3 with HC110-R revealed dissociation rate constants between 0,01 and 0,05 s-1 hence describing fast dissociations. Moreover, equilibrium dissociation constants were obtained for AF1 (KD=11 µM), AF10 (KD=52 µM) and PF2 (KD=530 µM). Functional analysis of potential ligands were carried out using stable transfected HEK-293 cells expressing the entire receptor. The neurotoxin alpha-latrotoxin was recently identified as an artificial agonist of HC110-R. Fluorescent Ca2+-measurements of Fura-2 loaded cells evoked a HC110-R-specific alpha-latrotoxin-induced rise in intracellular Ca2+ by approximately 219±14 nM. Intriguingly, none of the HC110-R binding neuropeptides elicited a Ca2+-response. Moreover, this study confirmed that the investigated neuropeptides did not function as antagonists by modulating alpha-latrotoxin induced Ca2+ response in HC110-R transfected HEK-293 cells. Furthermore, a screening for potential natural ligands was performed with the soluble fraction of a C. elegans protein extract. Two dimensional nitrocellulose binding assays combined with subsequent mass spectrometry revealed the heat shock protein Daf-21, an ortholog of Hsp-90, as a putative interaction partner of the aminoterminal region of HC110-R. This interaction was confirmed in vitro by using SPR-technology by the binding of a recombinant Daf-21 to a 54 kDa aminoterminal fragment of HC110-R. Predicted genetic interaction data of C. elegans showed, that Daf-21 might interact with another alpha-latrotoxin binding protein, protein-tyrosine phosphatase-3 (PTP-3) (Zhong and Sternberg, 2006).
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Molekulare Parasitologie
Dokument erstellt am:	27.11.2007
Dateien geändert am:	27.11.2007
Promotionsantrag am:	24.08.2007
Datum der Promotion:	12.11.2007