Charakterisierung und Anwendung von PAL, eines blaulichtabhängig RNA-bindenden Proteins

Titelangaben

Kaiser, Jennifer:
Charakterisierung und Anwendung von PAL, eines blaulichtabhängig RNA-bindenden Proteins.
Bayreuth , 2023 . - IV, 110, xxiv S.
( Dissertation, 2020 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Die Anwendung von Photorezeptoren, also durch Licht verschiedener Wellenlängen regulierbare Proteine, für die räumliche und zeitliche Kontrolle der Proteinaktivität -Lokalisierung und -Stabilität hat zu vielseitigen Fortschritten in der Grundlagenforschung und den angewandten Wissenschaften geführt. Das aus Nakamurella multipartita isolierte, neuartige, lichtabhängig RNA-bindende Protein PAL erlaubt nun auch die direkte Kontrolle zellulärer RNA-Spezies durch Beleuchtung mit blauem Licht. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von PAL mit zwei durch ein SELEX-Verfahren identifizierte Aptamer-Zielsequenzen in vitro durch Fluoreszenzanisotropie Messungen evaluiert und es wurden hohe Affinitäten mit KD-Werten von 12 nM und 17 nM im Licht im Vergleich zu einer ungefähr 100-fach geringeren Affinität im Dunkeln festgestellt. Eine Untersuchung der Interaktionskinetiken zeigte den Einfluss der Selektionskriterien des SELEX-Prozess auf die Eigenschaften der Aptamere auf. Es wurden durch Variation der Selektionsbedingungen Aptamere mit unterschiedlichen Dissoziationsraten erhalten Das PAL-Protein wurde in einem E. coli basierten Reportersystem eingesetzt, das im Verlauf dieser Arbeit entwickelt wurde und das eine 10-fache Repression eines Reportergens durch blaulichtabhängige RNA-Bindung ermöglicht. Dieses System stellt den ersten rekombinanten Einsatz des PAL-Proteins für eine optogenetische Anwendung dar und wurde verwendet, um eine umfangreiche Struktur-Funktionsanalyse durchzuführen. Zu diesem Zweck wurden sowohl Domänen- und Subdomänendeletionen als auch Punktmutationen in das Protein eingebracht. Die resultierende Proteinaktivität wurde anhand der Fluoreszenz des Reporterproteins ausgewertet. An einer Mutante, die ohne ein konserviertes Cystein im lichtadaptierten Zustand ein stabiles Radikal bildet, wurden EPR-Experimente zur Einschätzung der Dynamik des Proteins bei der Lichtantwort durchgeführt. Die Ergebnisse der Mutationsstudie im Zusammenhang mit den EPR-Messungen erlaubten einen ersten Entwurf des Mechanismus der RNA-Bindung und Signalweiterleitung von PAL. Eine Punktmutante von PAL, die ohne ein konserviertes Glutamin wildtyptische Aktivität aufwies, wurde identifiziert. Die Variante zeigte vorhandene Signaltransduktion und RNA-Bindung, wenn auch mit geringerer Affinität. Diese Feststellung führte zu weiteren Untersuchungen des Mechanismus der Lichtrezeption in LOV-artigen Photorezeptoren. Die Optimierung des entwickelten Reportersystems erlaubte das effiziente Screening von neuen Aptamer-Varianten, um nach Bindesequenzen für zwei im Verlauf der Arbeit identifizierte PAL-Homologe aus einem verwandten Nakamurella-Stamm zu suchen. Diese PAL-Varianten zeigten in in-vitro Untersuchungen ebenfalls typische LOV-Photochemie, interagierten jedoch nicht mit den zuvor identifizierten Aptameren. Zur Untersuchung von lichtaktivierter flüssig-flüssig-Phasenseparation wurde ein in-vitro-System basierend auf einem EYFP PAL-Fusionsprotein in Kombination mit einem EYFP-nanobody und polyvalenten RNA-Aptameren entworfen und charakterisiert. In ersten Experimenten konnte mittels Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie die lichtabhängige Bildung von Nukleationskeimen, nicht aber die makroskopische Phasenseparation des Systems beobachtet werden.

Abstract in weiterer Sprache

The application of photoreceptors, i.e. proteins regulated in their activity by illumination with light, has led to many advances in the applied and basic research, allowing precise spatiotemporal control of localization, activity and degradation of cellular components. The novel light-activated RNA binding protein PAL isolated from Nakamurella multipartita now allows for direct control of RNA-species via illumination with blue light. In this work the interaction of PAL with two SELEX-derived RNA-aptamer targets was evaluated with in vitro fluorescence anisotropy experiments, showing affinities in the light of 12 nM and 17 nM respectively and more than 100-fold lower affinity in the dark. The interaction kinetics were investigated, showing differences in the interaction mode caused by varied selection criteria during the SELEX-process. By varying the stringency of selection conditions, two aptamers with distinct dissociation rate constants were obtained. The PAL protein was transferred to an E. coli based reporter system realized in the course of this work, allowing 10-fold repression of reportergene expression as a result of blue-light dependent RNA-binding. This system represents the first use of PAL as a recombinant photoreceptor for optogenetic applications and was utilized for an extensive structure-function study. For this purpose, domain- and subdomain deletions as well as point mutations were introduced into PAL and the activity of the protein evaluated by the fluorescence of the reporter protein. A PAL mutant lacking a conserved Cystein, resulting in the formation of a stable radical on the chromophore upon illumination, was utilized to conduct EPR-measurements to probe the dynamics of PAL during light adaptation. The mutation study together with the conducted EPR-measurements allowed for the proposition of a mechanistic model for signal-transduction and RNA-binding in the PAL-protein. A PAL protein variant missing a conserved glutamine was found to confer wild typical activity. Analysis with the anisotropy assay developed in this work proved intact RNA interaction with a reduced affinity and strong dependence on buffer conditions. This finding spurred further research on the light reception of LOV-like photoreceptors. Optimization of the developed reporter system made it an efficient platform for screening novel aptamer variants binding to two novel PAL-homologes that were discovered in a related Nakamurella-strain and also characterized in vitro. The homologes showed a canonical photocycle but did not bind to the previously discovered aptamer-sequences. An in-vitro system based on an EYFP PAL-fusion protein in combination with an EYFP-nanobody and polyvalent aptamers was designed and characterized to investigate light activated liquid-liquid-phase separation. In initial experiments, formation of nucleation particles but no macroscopic phase separation events could be observed with fluorescence-cross-correlation spectroscopy.