Engineering and Characterization of RNA-binding LOV photoreceptors

Titelangaben

Ziegler, Thea:
Engineering and Characterization of RNA-binding LOV photoreceptors.
2020 . - 163 S.
( Dissertation, 2019 , Universität Bayreuth, Fakultät für Biologie, Chemie und Geowissenschaften)

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Abstract

Light-Oxygen-Voltage (LOV) photoreceptors are light-sensitive signaling proteins that provide responses to light in the ultraviolet and blue regions of the spectrum. The light stimulus is transmitted to the functional output via structural rearrangements within the light-sensing domain, which consequently modulates the activity of the signaling protein. In recent years, the compact LOV modules have become popular scaffolds for constructing new optogenetic tools. The latter enable precise spatiotemporal control over diverse biological targets in a light-dependent manner. While many photoreceptors convey control over DNA-associated processes, so far there is no candidate that directly acts on RNA. The aim of this work was therefore to provide a novel approach for the light-controlled regulation of RNA molecules, either by identifying and characterizing a naturally occurring photoreceptor that fulfils the desired property of light-regulated RNA binding, or by recombining a well-characterized LOV photosensor with a suitable RNA-binding output domain. Searching for previously uncharacterized photoreceptor candidates in the sequence databases, we discovered a promising gene entry in the gram-positive actinobacterium Nakamurella multipartita. The putative protein product comprises an N-terminal PAS (Per-ARNT-Sim) domain, followed by an RNA-binding ANTAR (AmiR and NasR transcription antitermination regulator) domain and a Cterminal LOV domain, accordingly referred to as 'PAL'. Based on the domain arrangement, we assumed that the RNA-binding function of the ANTAR domain may be controlled by the blue-lightresponsive LOV domain. We thus amplified the PAL gene from the genomic DNA of N. multipartita and confirmed its sequence identity via DNA sequencing. Next, PAL was heterologously expressed in Escherichia coli and purified via immobilized ion affinity chromatography. The purified PAL contains a flavin chromophore and undergoes the characteristic LOV photochemistry after blue light activation. We then applied SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) to determine specific RNA target sequences for PAL and found two different motif families defined by a common consensus sequence. The five most promising variants were analyzed with the help of electrophoretic mobility shift assays for their binding properties to PAL. The PAL photoreceptor demonstrates a blue-light-triggered binding activity for all of the thereby tested constructs with an apparent KD of around 0.25 µM for the best-binding aptamer under light conditions, which represents an approximate 30-fold increase compared to the corresponding binding activity in the dark. By optimizing the best-binding aptamer, we achieved binding affinities in the nanomolar range (30 ± 3 nM). Regarding the structural and mechanistic investigations of the PAL photoreceptor, we succeeded in obtaining the full-length crystal structure of PAL in its dark-adapted state with a resolution of 2.75 Å. The three-dimensional structure illustrates how signal transmission can be achieved within a LOV photoreceptor with the unusual domain topology of an N-terminally positioned output domain. With a combination of SEC-MALS (Size Exclusion Chromatography 10 combined with Multi-Angle-Light-Scattering) and SEC (Size Exclusion Chromatography) experiments, we demonstrated that both the full-length PAL protein, as well as the isolated LOV domain, occur as a dimer in solution independently of the light conditions. Moreover, we used the architecture of PAL as a design template for the development of further light-regulated RNA-binding proteins with an altered sequence specificity, and were able to generate light-sensitive constructs by replacing the PAL ANTAR domain with that of AmiR from Pseudomonas aeruginosa. The results indicate a great potential of PAL for use in optogenetic applications, as it opens the possibility of generating lightdependent RNA-protein interactions with high affinity. In addition, the structural studies on PAL provide valuable mechanistic insights that will facilitate the improvement of PAL as an optogenetic tool, as well as the construction of novel PAL-oriented chimeric photoreceptor variants.

Abstract in weiterer Sprache

Light-Oxygen-Voltage (LOV) Photorezeptoren sind licht-sensitive Proteine, die Antworten auf Licht im ultravioletten und blauen Bereich des Spektrums vermitteln. Das Lichtsignal wird über strukturelle Umlagerungen innerhalb der Sensor-Domäne zum funktionalen Output weitergeleitet, wodurch die Aktivität des Proteins moduliert wird. In den letzten Jahren sind die kompakten LOV Module zu beliebten Vorlagen für die Konstruktion neuer optogenetischer Tools geworden. Letztere ermöglichen aufgrund ihrer Lichtregulierbarkeit eine präzise raumzeitliche Kontrolle über diverse biologische Targets. Während bereits zahlreiche Photorezeptoren existieren, die Kontrolle über DNAassoziierte Prozesse vermitteln, gibt es bisher keinen Kandidaten, der direkt mit RNA interagiert. Ziel dieser Arbeit war es daher einen neuen Ansatz für die lichtsteuerbare Regulierung von RNAMolekülen zu entwickeln. Mögliche Strategien hierfür sind die Identifizierung und Charakterisierung eines natürlich vorkommenden Photorezeptors, der die gewünschte Eigenschaft der lichtgesteuerten RNA-Bindung erfüllt, oder die Rekombination eines gut charakterisierten LOV-Photosensors mit einer geeigneten RNA-bindenden Output-Domäne. Auf der Suche nach möglichen Photorezeptorkandidaten in den Sequenzdatenbanken entdeckten wir einen vielversprechenden Eintrag im grampositiven Aktinobakterium Nakamurella multipartita. Das mutmaßliche Proteinprodukt umfasst eine N-terminale PAS (Per-ARNT-Sim) Domäne, gefolgt von einer RNAbindenden ANTAR (AmiR and NasR transcription antitermination regulator) Domäne und einer Cterminalen LOV Domäne, weshalb wir es als 'PAL' bezeichneten. Basierend auf der Domänenanordnung vermuteten wir, dass die RNA-bindende Funktion der ANTAR Domäne einer von der LOV Domäne ausgehenden Blaulicht-Kontrolle unterlegen sein könnte. Daher amplifizierten wir das PAL Gen aus der genomischen DNA von N. multipartita und bestätigten die Sequenzidentität anhand von DNA-Sequenzierung. Anschließend reinigten wir das PAL Protein via Affinitätschromatographie aus Escherichia Coli auf. Das heterolog aufgereinigte PAL enthält einen Flavin Chromophor und durchläuft nach Blaulicht-Aktivierung die charakteristische LOV Photochemie. Daraufhin wandten wir das SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) Verfahren an um damit spezifische RNA Zielsequenzen für PAL zu ermitteln. Auf diesem Weg identifizierten wir zwei verschiedene Motiv-Familien, die ein gemeinsame Konsensus Sequenz aufweisen. Die fünf vielversprechendsten Varianten wurden anschließend mithilfe von EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assays) auf ihre Bindeeigenschaften zu PAL untersucht. Der PAL Photorezeptor zeigte dabei eine blaulicht-induzierte Bindeaktivität für alle getesteten Konstrukte. Das bestbindende Aptamer demonstrierte hierbei unter Blaulicht eine scheinbare KD von etwa 0.25 µM, was einer rund 30-fachen Steigerung gegenüber der entsprechenden Bindeaktivität im Dunkeln entspricht. Durch Optimierung des bestbindenden Aptamers erreichten wir schließlich BindeAffinitäten im nanomolaren Bereich (30 ± 3 nM). 12 Im Rahmen der strukturellen und mechanistischen Untersuchungen des PAL-Photorezeptors gelang es uns die Volllängen-Kristallstruktur von PAL im dunkel-adaptierten Zustand mit einer Auflösung von 2,75 Å zu erhalten. Die dreidimensionale Struktur veranschaulicht, wie die Signalübertragung innerhalb eines LOV Photorezeptors mit der ungewöhnlichen Topologie eines N-terminal positionierten funktionalen Outputs erreicht werden kann. Mit einer Kombination aus SEC-MALS (Size Exclusion Chromatography combined with Multi-Angle-Light-Scattering) und SEC (Size Exclusion Chromatography) Experimenten konnten wir zeigen, dass sowohl PAL als auch die isolierte PAL LOV Domäne unabhängig von den Lichtbedingungen als Dimer in Lösung vorkommen. Weiterhin nutzten wir die Architektur von PAL als Designvorlage für die Entwicklung weiterer lichtregulierbarer RNAbindender Proteine mit veränderter Sequenzspezifität. Durch den Austausch der PAL ANTAR Domäne mit der des AmiR Proteins aus Pseudomonas aeruginosa, konnten wir licht-regulierbare Chimären erzeugen. Die bisher erbrachten Ergebnisse deuten auf ein großes Potential von PAL für den Einsatz in optogenetischen Anwendungen hin, da es die Möglichkeit eröffnet lichtabhängige RNA-ProteinInteraktionen mit hoher Affinität zu erzeugen. Die strukturellen Untersuchungen an PAL liefern darüber hinaus wertvolle mechanistische Einblicke, die die Optimierung von PAL für den Einsatz als optogenetisches Tool, sowie die Konstruktion weiterer PAL-orientierter chimärer Photorezeptoren ermöglichen.