The dual use of cohesin and its protector Sgo1 contributes to the choreography of the chromosome and the centrosome cycle

Titelangaben

Schöckel, Laura:
The dual use of cohesin and its protector Sgo1 contributes to the choreography of the chromosome and the centrosome cycle.
Bayreuth , 2012 . - III, 139 S.
( Dissertation, 2012 , Universität Bayreuth, Bayreuther Graduiertenschule für Mathematik und Naturwissenschaften - BayNAT )

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Abstract

Supernumerous centrosomes cause chromosome mis-segregation and genomic instability, thereby likely contributing to the development of cancer. Centrosome duplication in S phase requires the preceding licensing step in late mitosis/early G1 phase, centriole disengagement. Reminiscent of the control of chromosome number, this dependence usually ensures that centrosomes are duplicated only once per cell cycle. The multi-subunit protein complex cohesin forms a tripartite Scc1-Smc1-Smc3-ring around sister chromatids. In early mitosis cohesin is removed from chromosome arms by the phosphorylation-dependent prophase pathway. During this time, centromeric cohesin is protected by shugoshin 1 and protein phosphatase 2A (Sgo1-PP2A). It is opened only in anaphase by separase-dependent cleavage of Scc1, which triggers chromosome segregation. Shortly thereafter, centrioles loosen their tight orthogonal arrangement, which licenses later centrosome duplication in S-phase. While a role of separase in centriole disengagement has been reported, the molecular details of this process remain enigmatic. Extending recent studies on cultured cells, this work reveals in a reconstituted system that the proteolytic activity of separase is required for centriole disengagement, while its other known function as Cdk1-inhibitor is dispensable. Consistent with previous reports, cohesin is found to be associated with centrosomes and its centrosomal localization is further fine-mapped by electron microscopy. Importantly, a hitherto unknown function of cohesin in centriole engagement is unraveled. Both premature sister chromatid separation and centriole disengagement are induced in vivo by premature activation of separase or depletion of Sgo1. These unscheduled events are suppressed by expression of non-cleavable Scc1 or inhibition of the prophase pathway. Moreover, centriole disengagement can be artificially triggered by a site-specific protease unrelated to separase when endogenous Scc1 has previously been replaced by a correspondingly engineered variant. Separation of centrioles can even be induced by ectopic cleavage of cohesin, i.e. within an engineered Smc3. Thus, the chromosome and centrosome cycles exhibit extensive parallels and are coordinated with each other by dual use of the cohesin ring complex. The second part of this thesis comprises the analysis and functional characterization of differently spliced Sgo1 isoforms. The data presented in this thesis identified a short alternatively spliced exon that not only directs human Sgo1 to centrosomes but at the same time abrogates also its association with centromeres. The change of just three consecutive amino acids within the corresponding peptide inactivates both the pro-centrosomal as well as the anti-centromeric targeting effect. Importantly, localization closely correlates with function as revealed by knockdown-rescue experiments: Depletion of all Sgo1 isoforms by RNAi resulted in unscheduled loss of sister chromatid cohesion as well as centriole engagement. Selective expression of individual Sgo1 isoforms from siRNA resistant transgenes demonstrated that centromere-associated Sgo1 variants shield only sister chromatid cohesion. Contrary, centrosomally bound isoforms of Sgo1 exclusively preserve centriole engagement. Expression of the relevant exon in fusion with eGFP or shugoshin 2 (Sgo2) directs both proteins to centrosomes but enables only the Sgo2-based chimera to now protect centriole engagement. This demonstrates that 1) the centrosome localization signal of Sgo1 is transferable, and 2) targeting per se is necessary but not sufficient for protection of centrosomal cohesin. Consistent with shugoshin´s mode of action at centromeres, centrosome-associated variants with an altered PP2A binding site are compromised in their ability to sustain centriole engagement. Based on these findings, it is tempting to speculate that an expression imbalance between the differently specialized Sgo1 isoforms could interfere with the crucial synchrony between the chromosome- and the centrosome cycles.

Abstract in weiterer Sprache

Eine Überzahl an Zentrosomen ist ein häufiges Kennzeichen von Krebszellen und trägt vermutlich zur Tumorgenese bei. Die Zentriolentrennung am Ende der Mitose ist eine Voraussetzung für eine akkurate Zentrosomenverdopplung während der S Phase und damit ein wichtiger Prozess zur Kontrolle der Zentrosomenanzahl. Dieser Lizenzierungsschritt stellt sicher, dass sich die Zentrosomen nur einmal pro Zellzyklus verdoppeln und erinnert an die Kontrolle der Chromosomenanzahl. Die Schwesterchromatide eines jeden Chromosoms werden in der S Phase synthetisiert und gleichzeitig von einem sie ringförmig umschließenden Multi-Proteinkomplex, Kohäsin genannt, miteinander verbunden. Ihre Trennung in der nachfolgenden Mitose erfolgt bei Vertebraten in zwei Stufen. Zunächst wird Kohäsin von den Chromosomenarmen durch den phosphorylierungsabhängigen Prophaseweg entfernt. Zentromerisches Kohäsin wird während der Prophase durch Shugoshin 1 und Protein Phosphatase 2A (Sgo1-PP2A) geschützt und erst in der Anaphase entfernt, wenn Separase die Scc1 Untereinheit schneidet. Unmittelbar nach der Schwesterchromatidtrennung folgt die Trennung der Zentriolen, ein Prozess in dem Separase eine Rolle zukommt, wobei jedoch die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen nicht geklärt sind. Offen bleibt außerdem die Frage, welches zentrosomale Protein dabei von Separase geschnitten wird. In der vorliegenden Arbeit ist in einem zellfreien System gezeigt worden, dass die proteolytische Aktivität von Separase für die Zentriolentrennung benötigt wird während seine Cdk1- inhibierende Aktivität entbehrlich ist. Verschiedene zell- und molekularbiologische Experimente machen deutlich, dass Kohäsin die Zentriolen zusammenhält und das gesuchte Zielsubstrat von Separase darstellt. Wie bereits in der Literatur beschrieben, lokalisiert Kohäsin an die Zentrosomen, was in dieser Arbeit durch Elektronenmikroskopie präzisiert wird. Außerdem konnten sowohl die frühzeitige Schwesterchromatidtrennung als auch die verfrühte Zentriolentrennung durch ektopische Aktivierung von Separase oder Depletion von Sgo1 ausgelöst werden. Beide unplanmäßigen Trennungen werden unterdrückt, wenn ein durch Separase nicht-spaltbares Scc1 exprimiert oder der Prophaseweg inhibiert wird. Wenn endogenes Kohäsin durch ein artifizielles Kohäsin ersetzt wird, welches durch eine Separase-unverwandte Protease geschnitten werden kann, so führt die Zugabe der betreffenden Protease zur spezifischen Trennung beider Zentriolen. Dabei ist es interessanterweise unerheblich, welche Untereinheit des Kohäsin geschnitten wird, solange sich dabei nur der Kohäsin-Ring öffnet. Die Entfernung des gleichen Kohäsin Komplexes koordiniert also die Trennung der Schwesterchromatiden und die Lizenzierung der späteren Zentrosomenverdopplung. So werden der Chromosomen- und Zentrosomenzyklus sinnvoll aufeinander abgestimmt. Der zweite Teil dieser Arbeit beinhaltet die Analyse und funktionelle Charakterisierung von unterschiedlich gespleißten Sgo1 Isoformen. Es wurde berichtet, dass eine durch alternatives Spleißen entstandene Isoform von Sgo1 nicht am Zentromer sondern vielmehr am Zentrosom lokalisiert und dort die vorzeitige Trennung der Zentriolen verhindert. Inspiriert von dieser Studie wurden stabile Zelllinien generiert, die verschiedene induzierbare Sgo1 Varianten von siRNAresistenten Transgenen exprimieren. Dies ermöglichte es, alle endogenen Sgo1 Varianten durch RNAi zu depletieren und durch einzelne Isoformen zu ersetzen. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass ein alternativ gespleißtes Exon nicht nur humanes Sgo1 zu den Zentrosomen rekrutiert sondern gleichzeitig auch die Assoziation mit dem Zentromer verhindert. Der Austausch von drei aufeinanderfolgenden Aminosäuren in dem entsprechenden Peptid unterdrückten die Rekrutierung an das Zentrosom und zwangen Sgo1 an das Zentromer. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass die Lokalisation von Sgo1 mit dessen Funktion korreliert. Demzufolge schützt Zentromer-assoziertes Sgo1 die Kohäsion der Schwesterchromatide, während Zentrosomen-gebundenes Sgo1 ausschließlich den Zusammenhalt der Zentriolen bewahrt. Die Expression von Fusionskonstrukten verdeutlichte, dass die zentrosomale Lokalisationssequenz des bifunktionellen Peptides zum einen übertragbar und notwendig für die Rekrutierung an das Zentrosom ist, zum anderen jedoch alleine nicht ausreicht, um das zentrosomale Kohäsin zu schützen. Übereinstimmend werden Zentrosomen-assozierte Sgo1 Varianten, die eine mutierte PP2A Bindestelle besitzen, in ihrer Fähigkeit eingeschränkt, den Zusammenhalt der Zentriolen zu gewährleisten. Basierend auf diesen Daten lässt sich mutmaßen, dass ein Ungleichgewicht im Expressionsstärke der unterschiedlich spezialisierten Sgo1 Isoformen die Synchronisation von Chromosomen- und Zentrosomenzyklus beeinträchtigt und dadurch möglicherweise zur Krebsentstehung beiträgt.