Structural Basis for TGF-β-Receptor Interaction and Antibody Recognition of HCMV Envelope Protein gB
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The transforming growth factor-β receptor type 3 (TGFR-3) is a membrane-anchored proteoglycan that features a zona pellucida (ZP) domain in its extracellular portion (from amino acids 454 to 728). However, unlike representative ZP domain-containing proteins, TGFR-3 is not involved in the formation of polymeric networks and rather acts as an accessory mediator of receptor:ligand interaction within TGF-β-dependent signal transduction processes. Initial protein characterisation experiments revealed the location of one TGF-β2-binding site in between the ZP domain sequence and the transmembrane domain. Although the TGF-β signalling pathway is more and more structurally investigated, detailed information on the recognition of TGF-β2 by TGFR-3 is scarce. This work aimed i) at the precise identification of the TGF-β2-binding site within the membrane proximal sequence of mouse TGFR-3 and ii) the structural investigation of the protein´s ZP domain by X-ray crystallography. Determination of the binding site was performed by the use of peptide sequences that finally enabled delineation of the responsible element to a stretch of not more than 14 amino acids within a prominent, surface-exposed loop. For structure determination purposes, a fragment of the whole receptor was explored, termed TGFR-3-ZP, including residues 438-782. Here, the 2.7 Å crystal structure of the C-terminal ZP subdomain (ZP-C) of mouse TGFR-3 is presented. Together with the results from peptide analysis and the homologue structure of rat TGFR-3-ZP-C, a possible receptor:ligand complex model is suggested. The second part of this work focusses on the molecular basis for antibody recognition of the antigenic domain 4 (AD-4) from human cytomegalovirus (HCMV) glycoprotein B (gB). During viral infection, gB acts as the main fusogen and accomplishes virus entry into host cells. Here, the high-resolution crystal structures of isolated AD-4, the neutralising monoclonal antibody fragment SM5-1 Fab, and the AD-4:SM5-1 Fab complex are presented to atomic resolutions of 1.8 Å, 1.9 Å, and 2.1 Å, respectively. The crystal structure of the complex reveals that binding of the antibody SM5-1 is dominated by an extraordinary long and exposed heavy chain CDR H3 with additional contribution from light chain CDR L1. CDRs H3 and L1 act in a concerted mechanism by targeting two linear sequence stretches on the antigen surface. The triplet of solved structures provides an overall view of antigen recognition by SM5-1. Finally, a hypothetical model for antibody-induced virus neutralisation can be inferred from the crystal structure of the complex, when the structure is transferred onto models of full length HCMV gB ectodomain in different conformational states.
Abstract
Der Typ 3 Rezeptor des transformierenden β-Wachstumsfaktors (TGFR-3; transforming growth factor-β; TGF-β) ist ein membranverankertes Glykoprotein, welches extrazellulär eine zona pellucida (ZP)-Domäne enthält (Aminosäuren 454 bis 728). TGFR-3 ist als Hilfsrezeptor maßgeblich an der Rezeptor:Ligand-Wechselwirkung des TGF-β-abhängigen Signalweges beteiligt; im Gegensatz dazu sind die meisten anderen charakteristischen ZP-Proteine in die Bildung proteinogener Matrizes involviert. Erste Interaktionsanalysen ermöglichten die Lokalisierung einer TGF-β-Bindestelle in der Region zwischen der ZP-Domänensequenz und der Transmembrandomäne des Rezeptors. Im Rahmen dieser Arbeit sollte i) die membran-proximale TGF-β2-Bindestelle in TGFR-3 konkret definiert werden, und ii) die ZP-Domäne des Rezeptors mittels Röntgenstrukturanalyse untersucht werden. Die Charakterisierung der Bindestelle erfolgte über synthetisch hergestellte Peptide, welche eine Eingrenzung auf 14 Reste innerhalb einer gut zugänglichen, oberflächenexponierten Loop-Struktur zuließen. Für proteinkristallographische Experimente wurde ein Fragment des Rezeptors (Aminosäuren 438-782) verwendet. Dadurch konnte die Kristallstruktur der C-terminalen Subdomäne der ZP-Domäne (ZP-C) aus Maus-TGFR-3 bei einer atomaren Auflösung von 2.7 Å gelöst werden. Die Gesamtheit der hier präsentierten Ergebnisse unter Zuhilfenahme einer homologen ZP-C-Struktur aus Ratten-TGFR-3 ermöglicht zudem die Vorhersage eines potentiellen TGFR-3:TGF-β2 Modells. Der zweite Teil dieser Arbeit befasste sich mit der Aufklärung der molekularen Grundlage für die Antikörpererkennung der antigenen Domäne 4 (AD-4) des Hüllproteins Glykoprotein B (gB) aus dem humanen Zytomegalievirus (human cytomegalovirus; HCMV). GB stellt während der viralen Infektion das wichtigste Fusionsprotein dar, da es den Eintritt des Virus in die Wirtszelle gewährleistet. Die hochaufgelösten Kristallstrukturen der isolierten antigenen Domäne 4 (1.8 Å), eines AD-4-spezifischen Antikörperfragments (SM5-1 Fab; 1.9 Å) und des AD-4:SM5-1 Fab-Komplexes (2.1 Å) erlauben erstmals detaillierte Einblicke in die Wechselwirkung eines Antikörpers mit einem HCMV Hüllprotein. Aus der Komplexstruktur wird deutlich, dass die Interaktion vorranging durch einen auffällig langen, exponierten CDR H3 der schweren Kette bewerkstelligt wird, wobei zusätzlich der CDR L1 der leichten Kette beteiligt ist. Zusammen greifen beide CDRs zwei lineare Sequenzmotive auf der Oberfläche des Antigens an. Anhand der Kristallstrukturen konnte ein Modell erstellt werden, wie SM5-1 möglicherweise die Neutralisation des Virus durch Bindung an die Oberfläche infizierter Zellen bewirkt.
