Generation of effective designer dendritic cells for therapeutic cancer vaccination using RNA electroporation
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Therapeutic cancer vaccination with dendritic cells (DC) is a technology that yielded promising results, but still requires optimization. Understanding the signaling that governs the immunogenicity of DC is a prerequisite to improve this strategy. Various maturation and activation stimuli enhance the DC’s ability to induce robust, lasting, and effective tumor-specific T-cell responses. Bacterial products and cell-cell signaling are the most potent ones. Electroporation with mRNA allows the expression of functional signaling proteins to manipulate the DC accordingly. In this work human monocyte-derived DC were mRNA-electroporated to improve their immunogenicity and were directly compared. Transfection of an optimized CD40L-RNA into cytokine-cocktail-matured (cm)DC up-regulated co-stimulatory molecules and enhanced secretion of pro-inflammatory cytokines, especially IL-12p70. Immature DC (iDC), electroporated with a mixture of mRNA coding for CD40L, constitutively active TLR4, and CD70 (named TriMix) did not match the expression rates of mock-transfected cmDC and secreted high amounts of IL-12p70, but also of the immunoinhibitory cytokine IL-10. CD40L-cmDC and TriMix-iDC showed an enhanced ability to expand MelanA-specific CD8+ T-cells, whereby the expanded T cells stimulated with CD40L-cmDC maintained a higher CD27 expression indicating a more memory-like phenotype. One common denominator of these stimuli is the activation of NF-кB. Therefore, it was investigated whether constitutive activation of the essential NF-кB pathways inside the cells would lead to a stronger effect than indirect, receptor-mediated activation, which also can induce other signaling pathways. To activate the NF-кB-signaling pathway directly, stabilized, constitutively active mutants of IкB kinases (caIKK) were expressed in the DC by mRNA electroporation. This resulted in an increased expression of the maturation markers CD25, CD40, OX40L, CD70, CD80, CD83, and CD86, and enhanced secretion of TNF, IL-6, IL-8, and IL-12p70, even in cmDC, which produced IL-12p70 over more than 48 h after transfection, whereas IL-10 was secreted in very low quantities. Those effects were clearly enhanced when both caIKKα and caIKKβ were co-electroporated and correlated with the quantity of transfected RNA. Remarkably, the transfected DC kept their CCR7-mediated migratory capacity. Most importantly, the MelanA-specific cytotoxic T cells induced by caIKK-transfected DC combined high CD27 expression and a markedly enhanced secondary expandability with a high lytic capacity, without loss of functional avidity and exhaustion of the T cells. In contrast, cytotoxic T cells primed and expanded with unmodified “standard” cmDC could not maintain their proliferative capacity upon repetitive stimulations. The generation of DC out of leukapheresis or whole blood is a time-, material-, and money-consuming process. Hence in preclinical research, the need for alternative, more economic sources of monocytes is still at present. In this study, leukocyte reduction system chambers (LRSC) were determined to be an appropriate source to achieve high yields of DC out of the monocytes, contained in these chambers. The generated DC showed an expression pattern of surface molecules in their immature state and after cocktail-maturation similar to DC derived from whole blood or leukapheresis, and also displayed a similar T-cell-stimulation capacity. Taken together, this work supports the hypothesis that designer DC expressing constitutively active IκB kinases will prove highly immunogenic also in vivo, and possibly turn out to be a new strategy to improve the clinical efficacy of therapeutic cancer vaccinations. Additionally, LRSC were determined as an adequate source for the generation of DC in high yields for preclinical research.
Abstract
Die therapeutische Krebsimpfung mit dendritischen Zellen (DC, engl.: dendritic cells) ist eine Methode, die vielversprechende Ergebnisse erzielte, jedoch weiterer Optimierung bedarf. Die Signalübermittlung, die die Immunogenität der DC steuert, zu verstehen, ist eine Voraussetzung diese Strategie zu verbessern. Verschiedene Reifungs- und Aktivierungs-stimuli verbessern die Fähigkeit der DC stabile, andauernde und effektive tumorspezifische T-Zell-Antworten zu induzieren, wobei bakterielle Bestandteile und Zell-Zell Interaktionen zu den Wirksamsten zählen. Die Elektroporation mit mRNA erlaubt die Expression von funktionellen Signalproteinen um DC dementsprechend zu manipulieren. In dieser Arbeit wurden aus Monozyten generierte DC mit verschiedenen mRNAs elektroporiert um deren Immunogenität zu verbessern und miteinander zu vergleichen. Die Transfektion mit einer optimierten CD40L-RNA in mit Zytokin-Cocktail gereiften DC (cmDC, engl.: cocktail-matured) führte zu einer Hochregulation kostimulatorischer Moleküle und zu einer erhöhten Sekretion proinflammatorischer Zytokine, insbesondere IL-12p70. Unreife DC (iDC, engl.: immature), die mit einer Mischung aus mRNA, die für CD40L, konstitutiv aktiven TLR4 und CD70 kodiert (bezeichnet als „TriMix“), elektroporiert wurden, erreichten die Expressionsraten von mock-elektroporierten cmDC nicht. Zudem sekretierten die TriMix-iDC hohe Mengen IL-12p70, jedoch auch das immunoinhibitorische Zytokin IL-10. CD40L-cmDC und TriMix-iDC wiesen eine erhöhte Fähigkeit auf MelanA-spezifische CD8+ T-Zellen zu expandieren, wobei die expandierten T Zellen, die mit CD40L-cmDC stimuliert wurden eine höhere Expression an CD27 beibehielten, was mit einem Gedächtnis-ähnlichen Phänotyp übereinstimmt. Eine Gemeinsamkeit dieser Stimuli ist die Aktivierung von NF-κB. Aus diesem Grund wurde untersucht, ob die konstitutive Aktivierung der essentiellen NF-κB Signalwege innerhalb der Zellen zu einem stärkeren Effekt führt als eine indirekte, rezeptorvermittelte Aktivierung, welche ebenfalls andere Signalwege aktivieren kann. Um die direkte Aktivierung der NF-κB Signalwege zu erreichen, wurden stabilisierte, konstitutiv aktive Mutanten der IκB Kinasen (caIKK, engl.: constitutive active) in DC durch RNA-Elektroporation exprimiert. Dies führte zu einer gesteigerten Expression der Reifungsmarker CD25, CD40, OX40L, CD70, CD80, CD83 und CD86, sowie einer erhöhten Sekretion von TNF, IL-6, IL-8 und IL-12p70, sogar in cmDC. Reife DC produzierten IL-12p70 über mehr als 48 h nach Transfektion, wohingegen IL-10 in sehr geringen Maßen sekretiert wurde. Diese Effekte wurden deutlich gesteigert, wenn caIKKα und caIKKβ gemeinsam elektroporiert wurden und korrelierten mit der Menge der transfizierten RNA. Die transfizierten DC behielten bemerkenswerter Weise ihre Fähigkeit zur CCR7-vermittelten Migration bei. Am Wichtigsten ist jedoch, dass die MelanA-spezifischen zytotoxischen T-Zellen, die durch caIKK-transfizierte DC induziert wurden, eine hohe CD27-Expression und eine deutlich erhöhte sekundäre Expansionsfähigkeit mit einer hohen lytischen Fähigkeit kombinierten, ohne eine Verminderung der funktionellen Avidität aufzuweisen. Des Weiteren behielten die T-Zellen die Fähigkeit zu einer wiederholten Stimulation bei. Im Gegensatz dazu konnten zytotoxische T-Zellen, die mit unveränderten „standard“ DC stimuliert wurden, ihre proliferative Kapazität in wiederholten Stimulationen nicht aufrechterhalten. Die Generierung von DC aus Leukapheresen oder Vollblut ist ein zeitaufwendiger, materialverbrauchender und kostenintensiver Prozess. Somit besteht in der präklinischen Forschung stets die Notwendigkeit nach alternativen, wirtschaftlicheren Bezugsquellen von Monozyten. In dieser Arbeit wurden LRSC (engl.: leukocyte reduction system chambers) als eine geeignete Quelle ermittelt um eine hohe Ausbeute von DC aus Monozyten, die in diesen Kammern enthalten sind, zu erreichen. Die generierten DC zeigten in ihrem unreifen und zytokingereiften Stadium ein Expressionsmuster von Oberflächenmolekülen auf, das auf gleicher Weise bei DC, die aus Vollblut oder Leukapheresen stammen, zu finden ist und wiesen eine ähnliche T-Zell-Stimulationskapazität auf. Zusammenfassend untermauert diese Arbeit die Hypothese, dass „Designer DC“, die konstitutiv aktive IκB Kinasen exprimieren, auch in vivo eine starke Immunogenität aufzeigen und sich möglicherweise als eine neue Strategie zur Verbesserung der klinischen Effizienz von therapeutischen Krebsimpfungen herausstellen werden. Zusätzlich wurden LRSC als eine geeignete Quelle für die Generierung von DC in großen Mengen für die präklinische Forschung identifiziert.