Zytotoxische Funktion von T-Lymphozyten gegen Melanomzellen nach in vitro Stimulation mit einem Melanoma chondroitin sulfate proteoglycan (MCSP)xCD3 bispezifischen Antikörper
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1.2.1 Background and Objectives The incidence of malignant melanoma of the skin has increased rapidly within the last years. 80% of skin cancer related deaths are caused by malignant melanomas. The median survival time of stage IV patients ranges between four to six months and no drug except Ipilimumab has ever shown to effectively prolong overall survival. A novel therapeutic approach for the treatment of patients with malignant melanoma could be BiTEs. This class of bispecific antibodies is specific for CD3 and a selected tumour associated antigen, enabling T cells to bind to the target cell and induce target cell lysis. This study aims to analyse the functional activity of T lymphocytes against melanoma cells after stimulation with a MCSPxCD3 BiTE in vitro. 7 1.2.2 Methods Melanoma cell lines were cultured in vitro and analysed for mutations of the APM, the expression of relevant immunological proteins as well as the secretion of immunosuppressive molecules using PCR, FACS and ELISA techniques. Furthermore, three antigen-specific cytotoxic T cell clones were incubated with melanoma cells without any BiTE, with a control BiTE or with MCSP-BiTE. Using a 51chromium- release assay, the efficacy of the T cell induced lysis was determined. Moreover, out of co-cultures of melanoma cells and T cells with and without MCSP-BiTE, surviving melanoma cells were isolated. These cells were then tested for their sensitivity towards a T cell mediated killing. In addition, different CD3 positive T cell subpopulations were isolated out of healthy donors’ blood using cell sorting. These cells were then tested in a 51chromium-release for their ability to induce a BiTE mediated cytotoxic immune response against melanoma cells. 1.2.3 Results All melanoma cell lines analysed expressed MCSP and could be killed by clonal T cells in the presence of MCSP-BiTE. The capacity of T cells to kill melanoma cells upon BiTE stimulation was independent on different immunological factors. Melanoma cell lines sensitive to an antigen-specific killing showed no increased cytotoxicity after addition of MCSP-BiTEs. For one melanoma cell line, it could be shown that cells having survived a MCSP-BiTE mediated immune response subsequently revealed a decreased MCSP expression. These cells were also less sensitive against a MCSP-BiTE mediated kill than control cells not having been exposed to MCSP-BiTE before. All CD3 positive T cell subpopulations isolated out of healthy donors’ blood were effective to induce a BiTE mediated cytotoxic immune response against melanoma cells. 1.2.4 Conclusions These data clearly demonstrate that MCSP-BiTEs are able to induce a T cell mediated cytotoxic activity against MCSP positive melanoma cells regardless of the expression of different immunological factors. BiTEs might thus present an effective novel therapeutic approach for the treatment of patients with malignant melanoma. Of interest, melanoma cells, having survived BiTE mediated lysis, revealed a downregulation of MCSP. Downregulation of MCSP is a new tumour immune escape mechanism not having been described before in literature.
Abstract
1.1.1 Hintergrund und Ziele Das maligne Melanom der Haut gehört zu den Tumoren, dessen Inzidenz in den letzten Jahren am stärksten zugenommen hat. 80% aller Todesfälle durch Hautkrebs sind auf ein malignes Melanom zurückzuführen. Die mediane Überlebenszeit von Patienten im Stadium IV beträgt derzeit nur vier bis sechs Monate und kein Therapeutikum, mit Ausnahme von Ipilimumab, konnte diese bis dato effektiv verlängern. Einen neuartigen Therapieansatz für die Behandlung des malignen Melanoms stellen Bispecific T Cell Engagers (BiTEs) dar. Hierbei handelt es sich um ein bispezifisches Antikörperkonstrukt, das sowohl CD3 als auch das gewünschte TAA bindet. T-Zellen können so vorübergehend an die Zielzelle binden und nach Aktivierung diese lysieren. In der vorliegenden Arbeit soll die zytotoxische Funktion von T-Lymphozyten gegen Melanomzellen nach Stimulation mit einem MCSPxCD3 BiTE in vitro untersucht werden. 1.1.2 Methoden Melanomzelllinien wurden in vitro kultiviert und mittels PCR, FACS und ELISA auf Mutationen der APM, die Expression immunologisch relevanter Proteine bzw. die Sekretion immunsuppressiver Faktoren untersucht. Mittels 51Chrom-Release wurde die zytotoxische Funktion von drei CD8+-T-Zell-Klonen gegen Melanomzellen ohne BiTE, mit Kontroll-BiTE oder mit MCSP-BiTE bestimmt. Des Weiteren wurden Melanomzelllinien mit klonalen CD8+-T-Zellen in An- bzw. Abwesenheit von Kontroll- BiTE oder MCSP-BiTE inkubiert. Die überlebenden Melanomzellen wurden anschließend erneut charakterisiert und ihre Sensitivität gegenüber einem T-Zell mediierten Kill im 51Chrom Release bestimmt. Außerdem wurden verschiedene CD3+-T- Zell-Subpopulationen von gesunden Spendern mittels Zellsorting isoliert und im 51Chrom Release auf ihr Potential getestet, eine BiTE induzierte Immunantwort gegen Melanomzellen zu vermitteln. 1.1.3 Ergebnisse und Beobachtungen Alle untersuchten Melanomzelllinien exprimierten MCSP und ließen sich von klonalen T-Zellen in Anwesenheit von MCSP-BiTE lysieren. Mutationen der APM, die 6 Expression bekannter immunologisch relevanter Proteine wie PD-L1 und lösliche, immunsuppressive Faktoren wie IL-10 hatten hierauf keinen Einfluss. In Kokulturexperimenten, in denen Melanomzellen über antigenspezifische T-Zellen lysiert wurden, konnte durch die Zugabe von MCSP-BiTE keine Steigerung der Zytotoxizität erzielt werden. Für eine Melanomzelllinie konnte exemplarisch gezeigt werden, dass Melanomzellen, die eine MCSP-BiTE vermittelte Immunreaktion überlebt hatten, in der Folge eine verminderte Expression von MCSP aufwiesen. Diese Zellen waren gegenüber einem MCSP-BiTE mediierten Kill weniger sensitiv als die entsprechende Kontrolle. Alle aus MNCs isolierten CD3+-T-Zell-Subpopulationen waren in der Lage, eine MCSP-BiTE mediierte Immunantwort gegen Melanomzellen zu vermitteln. 1.1.4 PraktischeSchlussfolgerungen Die vorliegenden Daten lassen darauf schließen, dass MCSP-BiTEs eine wirkungsvolle Lyse von MCSP positiven Melanomzellen durch T-Zellen, unabhängig von verschiedenen immunologischen Faktoren, induzieren können. BiTEs stellen somit ein neuartiges, wirkungsvolles Therapeutikum für die Behandlung von Patienten mit malignem Melanom dar. Von Bedeutung sind die Ergebnisse zu den Melanomzellen, die einer BiTE vermittelten Lyse entkommen sind und in der Folge das MCSP Antigen herunterreguliert haben. Hierbei handelt es sich um einen bisher in der Literatur noch nicht beschriebenen Tumor-Immune-Escape-Mechanismus.