Regulation der Proteinstabilität durch virale und zelluläre Abbausignale und deren Einfluss auf die MHC-I Antigenpräsentation
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Abstract
Defective ribosomal products (DRiPs) are erroneous proteins that are degraded via the ubiquitin-protesome-system (UPS), concomitant or shortly after their biosynthesis. DRiPs represent the main source of endogenous determinants, that are presented on the cell surface in complex with major histocompatibility complex I (MHC-I) molecules. By the expression of instable antigen variants, that are rapidly degraded via the UPS, it is possible to induce a more efficient CD8+-T cell response than by expression of the metabolically stable antigen. In this work viral and cellular degradation singals were identified and their influence on protein stability, DRiP-rate and MHC-I antigen presentation was determined. In the first part of this thesis it was analysed if the PTAP late budding (L)-domain in the C-terminal p6-region of the human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) Gag-protein regulates its entry into the MHC-I pathway. It was already known, that the PTAP-motif, besides its function in virus release, also regulates the ubiquitination of Gag. It could be shown here, that mutation of the PTAP-motif enhances the lysine-48 linked polyubiquitination and the entry of Gag into the DRiP pathway and consequently clearly increases its MHC-I antigen presentation and immunogenicity in vitro. Therefore a naturally occuring HIV-1 sequence motif which regulates the immunogenicity of Gag could be identified for the first time. The aim in the second part of this thesis was to increase the immunogenicity of the tumor-associated antigen MelanA via a non-cleavable N-terminal fusion of ubiquitin (UbG76VMelanA). According to the ubiquitin fusion degradation (UFD) method the fused Ub moiety becames polyubiquitinated at either lysine 48 or 29 leading to an rapid transfer of the fusion protein into the UPS. In this work it could be shown that the stable fusion of Ub to the transmembranous protein MelanA clearly enhances its polyubiquitination, the entry into the UPS and thus its MHC-I antigen presentation. In contrast to the conventional wisdom concerning the UFD the presence of at least one, position independent lysine residue was sufficient to induce this phenomenon. In summary it has been shown in this thesis, that an enhanced entry of viral and cellular proteins into the DRiP pathway clearly increases their MHC-I antigen presentation and thus their immunogenicity. Consequently, the obtained results represent a new approach for the optimization of vaccination strategies.
Abstract
Fehlprodukte der Proteinbiosynthese, sogenannte defekte ribosomale Produkte (DRiPs), werden während oder kurz nach der Biosynthese über das Ubiquitin-Proteasom-System (UPS) abgebaut. Sie bilden die Hauptquelle für endogene Determinanten, die auf major histocompatibility complex I (MHC-I)-Molekülen präsentiert werden. Durch die Expression instabiler Antigenvarianten, welche schnell durch das UPS abgebaut werden, kann somit eine deutlich effizientere Induktion einer CD8+-T-Zellantwort erzielt werden als dies durch die Expression des natürlichen und metabolisch stabilen Antigens der Fall ist. In dieser Arbeit wurden virale und zelluläre Abbausignale identifiziert und deren Einfluss auf die Proteinstabilität, DRiP-Rate und MHC-I Antigenpräsentation charakterisiert. Im ersten Teil der Arbeit wurde untersucht, ob die PTAP late budding (L)-Domäne im C-terminalen p6-Bereich des humanen Immundefizienzvirus-1 (HIV-1) Gag-Strukturproteins dessen Eintritt in den MHC-I pathway reguliert. Es war bereits bekannt, dass das PTAP-Motiv, neben der Virusfreisetzung, auch die Ubiquitinylierung von Gag reguliert. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Mutation des PTAP-Motivs die Lysin-48 verlinkte Polyubiquitinylierung und den Eintritt von Gag in den DRiP-pathway erhöht und folglich die MHC-I Antigenpräsentation und Immunogenität in vitro deutlich steigert. Somit wurde erstmals ein natürliches HIV-1-Sequenzmotiv identifiziert, welches die Immunogenität von Gag reguliert. Im zweiten Teil der Arbeit sollte die Immunogenität des Tumor-assoziierten Antigens MelanA mittels einer nicht abspaltbaren, N-terminalen Ubiquitin-Fusion (UbVG76V-MelanA) erhöht werden. Die ubiquitin-fusion-degradation (UFD)-Regel besagt, dass das fusionierte Ub an den Lysinen 48 und 29 polyubiquitinyliert wird und somit das Fusionsprotein unmittelbar in das UPS geleitet wird. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die stabile Fusion von Ub an das transmembrane Protein MelanA dessen Polyubiquitinylierung, den Eintritt in das UPS und somit die MHC-I Antigenpräsentation deutlich erhöhen kann. Um den Eintritt in das UPS zu induzieren, war dabei, im Gegensatz zum bislang bekannten Mechanismus für den UFD-pathway, die Anwesenheit von nur einem, Positions-unabhängigen Lysin ausreichend und notwendig. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass ein erhöhter Eintritt von viralen und zellulären Proteinen in den DRiP-pathway deren MHC-I Antigenpräsentation und somit die Immunogenität deutlich steigert. Die erhaltenen Ergebnisse stellen daher einen neuartigen Ansatz für die Optimierung von Vakzinierungsstrategien dar.