Mimetische Peptide als molekulare Werkzeuge zur Analyse des HIV-1 Eintrittsprozesses
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The human immunodeficiency virus (HIV-1), which is the causative agent of the acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), enters its cells by utilizing its envelope (spike) multiprotein complex. The spike is trimer composed of gp120 and gp41. For fusion of HIV-1 with the host cell membrane, it interacts with its receptor (CD4) and a coreceptor (CCR5 or CXCR4). These interactions are initiated by gp120 and result in conformational changes inside of the spike that enable gp41 to mediate fusion of the viral and host cell membranes. Despite intensive research, AIDS can not be cured and causes more than 1.5 million deaths annually. Until today, a potent HIV-1 vaccine is still elusive. This is mainly due to intensive immune escape mechanisms and shielding of potently neutralizing epitopes on the virus, which is challenging for developing vaccines based on whole proteins or protein complexes (like the spike). To overcome this problem, peptides as binding site mimetics are suitable tools. Displaying only the CD4- or coreceptor-binding site of gp120 through peptides could therefore not only improve our understanding of the molecular details on virus - host cell interaction, but also display potent vaccines in the battle against HIV-1. In this study, the molecular details of the interaction of one CD4-binding site mimetic (CD4bs-M) as well as coreceptor-binding site mimetics (V3-loop peptides) were analysed. The previously published discontinuous binding site mimetic CD4bs-M had been shown to compete with gp120 for binding to CD4. Interestingly, it could be shown in the current study that CD4bs-M is able to bind to gp120 in direct ELISA. Furthermore, it strongly enhanced HIV-1 infection of susceptible target cells. This effect could be linked to the β20/β21-fragment of CD4bs-M, which is part of the bridging sheet of gp120. Using different substitution variants, it could be shown that a defined side-chain orientation, peptide backbone and spatial orientation of this fragment is necessary for the interaction with gp120 as well as the infection enhancement. Moreover, CD4bs-M was able to trigger infection of CD4-negative HeLa cells with HIV-1, leading to the hypothesis that the β20/β21-fragment of CD4bs-M adopts a defined conformation while interacting with gp120, which in turn facilitates interaction of gp120 with its coreceptors. In HIV-1 infection, the primary humoral immune response is preferentially directed against the V3-loop of gp120. Unfortunately, the generated antibodies have, in most cases, only a limited neutralizing capacity and can, therefore, be easily bypassed by HIV-1 through immune escape mechanisms like single nucleotide polymorphisms that cause an amino acid substitution or shielding of the corresponding epitopes. Nevertheless, some broadly neutralizing anti-V3-loop antibodies have been isolated from HIV-1 longterm non-progressors. Besides HIV-1 strains with amino acid substitutions in their V3-loop sequence, HIV-1 strains with amino acid insertions in the V3 loop are known. For example the HIV-1LAI strain, which HIV-1IIIB, HIV-1HxBc2 and HIV-1NL4.3 originate from, has a dipeptide insertion (QR insert) in the V3-loop tip. In this study, it could be shown, using V3-loop peptides containing insertions and deletions of this particular dipeptide, that most of the broadly neutralizing anti-V3-loop antibodies are strictly dependent on V3-loops that do not contain this insert. Immunisation of mice with two V3-loop peptides of strainHxBc2 (one with and one without QR-insert) resulted in antibody responses that were strictly dependend on the QR-insert. Using substitution analogs of the QR-insert in V3-loop peptides, it could be demonstrated that substitution of arginine to isoleucine renders the V3-loop capable at binding to the QR-dependent anti-V3-loop antibodies. V3-loop peptides with QI-Insertion could possibly serve as potent vaccines to induce antibodies that could recognize V3-loops with as well as without QR-insert and could thus be used to avoid immune escape of HIV-1 through amino acid insertions in the V3-loop tip. As the main determinant of coreceptor tropism, the V3-loop of gp120 had been intensively studied. However, due to the high complexity of the spike, as well as the barrier to study the membrane-bound coreceptors in in vitro assay systems like ELISA, the interaction of the V3-loop with the corresponding coreceptor (CCR5 or CXCR4) is not well understood. To overcome this problem, a CXCR4 coreceptor mimetic peptide, called CX4-M1, was recently developed in our group that mimics the three extracellular loops of the coreceptor. This mimetic is able to selectively bind gp120 of CXCR4-using HIV-1, whereas gp120 of CCR5-using HIV-1 is not recognized. Furthermore, CX4-M1 is able to inhibit HIV-1 infection of CXCR4-using HIV-1. In this study, it could be shown that CX4-M1 not only discriminates between gp120 of different tropism, but also selectively recognizes V3-loop peptides of CXCR4-using HIV-1. In addition, it could be shown in infection assays that a V3-loop peptide of CXCR4-using HIV-1 is able to counteract infection inhibition through CX4-M1. Using substitution analogs of the V3-loop peptides as well as of the second extracellular loop of CX4-M1, the binding sites of both peptides for each other could be dissected on the level of individual amino acids. Beyond the exploration of the molecular details of this interaction, these results clearly demonstrate the feasibility of mimicking protein-protein interactions through peptide-peptide interactions. Peptides are therefore valuable tools to dissect the molecular mechanism of HIV-1 entry into cells and have the potential to serve as new drugs and vaccines.
Abstract
Das humane Immundefizienzvirus (HIV-1) löst das erworbenen Immundefizienz-syndrom (AIDS) aus. Es tritt mittels seines Hüll-Multiproteinkomplexes, dem Spike, in die Zelle ein. Der Spike besteht aus einem Trimer, welches durch gp120 und gp41 aufgebaut wird. Für die Fusion von HIV-1 mit der Wirtszellmembran muss der Spike mit dem Rezeptor (CD4) und einem Corezeptor (CCR5 oder CXCR4) interagieren. Diese Interaktionen werden durch gp120 vermittelt und führen zu Konformationsänderungen, welche gp41 zur Vermittlung der Fusion von Virus- und Wirtszellmembran befähigen. Trotz intensiver Forschung kann AIDS nicht geheilt werden und verursacht jährlich 1,5 Millionen Todesfälle. Bis heute wurde noch kein wirksamer Impfstoff gegen HIV-1 entwickelt. Dies ist hauptsächlich damit zu begründen, dass HIV-1 durch hohe Mutationsraten sowie Verdeckung von potentiell neutralisierenden Epitopen dem Immunsystem entkommt, was die Entwicklung von Impfstoffen auf der Basis ganzer Proteine oder Proteinkomplexe (zum Beispiel dem Spike) zusätzlich erschwert. Eine mögliche Lösung dieses Problems könnte der Einsatz von Immunogenen auf der Basis peptidischer Bindungsstellenmimetika darstellen. Die Präsentation einzelner Bindungsstellen auf gp120 durch Peptide, wie zum Beispiel die CD4-Bindungsstelle oder die Corezeptorbindungsstelle, könnte nicht nur das Verständnis der molekularen Details der Virus-Wirtszellinteraktion verbessern, sondern auch potentielle Impfstoffe im Kampf gegen HIV-1 bereitstellen. In der vorliegenden Arbeit wurden die molekularen Details der Interaktion eines CD4-Bindungsstellenmimetikums (CD4bs-M) sowie von Corezeptorbindungsstellen-mimetika (V3-Schleifen-Peptide) näher untersucht. Bereits 2007 konnte gezeigt werden, dass das diskontinuierliche Bindungsstellenmimetikum CD4bs-M mit gp120 um die Bindung an CD4 kompetierte. Interessanterweise konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass CD4bs-M in der Lage ist, an gp120 im direkten ELISA zu binden. Desweiteren konnte CD4bs-M die HIV-1-Infektion von CD4-positiven Zielzellen deutlich verstärken und zusätzlich die Infektion CD4-negativer HeLa-Zellen mit HIV-1 vermitteln. Dieser Effekt konnte mit dem β20/β21-Fragment dieses Mimetikums in Verbindung gebracht werden, welches Teil des Bridging sheets von gp120 ist. Durch den Einsatz verschiedener Substitutionsvarianten konnte gezeigt werden, dass eine definierte Seitenketten- und Peptidrückgratorientierung, sowie eine definierte räumliche Anordnung dieses Fragments für die beobachteten Effekte erforderlich sind. Es konnte gezeigt werden, dass die Infektions-vermittelnde Wirkung von CD4bs-M Corezeptor-abhängig ist, und somit einen Einfluss auf die Fusion von HIV-1 mit der Wirtszellmembran besitzen könnte. Während der Infektion mit HIV-1 ist die primäre Immunantwort gegen die V3-Schleife von gp120 gerichtet. Unglücklicherweise sind die gebildeten Antikörper in den meisten Fällen nicht breit neutralisierend und können demzufolge von HIV-1 durch verschiedene Fluchtmechanismen vor dem Immunsystem umgangen werden, wie zum Beispiel durch Einzelnukleotid-Polymorphismen, die eine Aminosäure-Substitution zur Folge haben, oder Verdeckung des entsprechenden Epitops. Trotzdem wurden von einigen HIV-1 positiven Langzeitüberlebenden breit-neutralisierende anti-V3-Schleifen-Antikörper gebildet. Neben Aminosäure-Substitutionen in der V3-Schleifen-Sequenz kommen auch HIV-1-Stämme mit Aminosäure-Insertionen in der V3-Schleife vor. Ein Beispiel hierfür ist HIV-1LAI, aus dem zum Beispiel HIV-1IIIB, HIV-1HxBc2 und HIV-1NL4.3 hervorgegangen sind. Diese Stämme haben eine Dipeptid-Insertion (QR-Insertion) in der V3-Schleifen-Spitze. In der vorliegenden Arbeit konnte mittels V3-Schleifen-Peptiden mit beziehungsweise ohne QR-Insertion gezeigt werden, dass die meisten breit neutralisierenden anti-V3-Schleifen-Antikörper eine klare Selektivität für V3-Schleifen-Peptide ohne QR-Insertion besitzen. Die Immunisierung von Mäusen mit zwei V3-Schleifen-Peptiden des Stammes HxBc2 (mit und ohne QR-Insertion) führte zu strikt QR-abhängigen anti-V3-Schleifen-Antikörpern. Mittels Substitutionsvarianten innerhalb der QR-Insertion der V3-Schleifen-Peptide konnte gezeigt werden, dass der Austausch von Arginin durch Isoleucin das V3-Schleifen-Peptid dazu befähigt, an Antikörper mit einer Selektivität für V3-Schleifen ohne QR-Insertion zu binden. Diese QI-Insertion-enthaltenden Peptide könnten möglicherweise als potentielle Impfstoffe zur Erzeugung von Antikörpern eingesetzt werden, welche sowohl Peptide mit als auch ohne QR-Insertion erkennen könnten, und somit die Flucht von HIV-1 vor dem Immunsystem durch Aminosäure-Insertionen in der V3-Schleifen-Spitze vorbeugen. Als Hauptdeterminante des Tropismus wurde die V3-Schleife aus gp120 intensiv untersucht. Trotzdem ist die Interaktion der V3-Schleife auf gp120 mit dem Corezeptor (CCR5 oder CXCR4) sowohl aufgrund der großen Komplexität des Spikes, als auch der Limitation der Studie membranständiger Proteine, wie zum Beispiel dem Corezeptor, in in vitro Bindungsversuchen bis heute nicht gut verstanden. Um diesen Problemen entgegenzuwirken, wurde ein CXCR4-Corezeptormimetikum, genannt CX4-M1, in unserer Arbeitsgruppe entwickelt, welches die drei extrazellulären Schleifen des Corezeptors präsentiert. Dieses Peptid ist in der Lage, selektiv gp120 von CXCR4-verwendendem HIV-1 zu binden, wohingegen gp120 von CCR5-verwendendem HIV-1 nicht erkannt wurde. Desweiteren konnte die Infektion von Zellen mit CXCR4-verwendendem HIV-1 durch CX4-M1 inhibiert werden. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass CX4-M1 nicht nur in der Lage ist, zwischen dem Tropismus des HIV-1 Hüllproteins gp120 zu unterscheiden, sondern auch selektiv V3-Schleifen-Peptide von CXCR4-verwendendem HIV-1 zu erkennen. Zusätzlich konnte in Infektionsversuchen gezeigt werden, dass ein V3-Schleifen-Peptid eines CXCR4-verwendenden HIV-1 in der Lage ist, der Infektionsinhibition durch CX4-M1 entgegenzuwirken. Mittels Substitutionsvarianten sowohl dieses V3-Schleifen-Peptids als auch der zweiten extrazellulären Schleife von CX4-M1 konnten die Bindungsstellen beider Peptide füreinander auf der Basis individueller Aminosäuren charakterisiert werden, die wichtig für deren Interaktion sind. Über die Erforschung der molekularen Details dieser Interaktion hinaus zeigen die Ergebnisse eindeutig, dass Protein-Protein-Interaktionen durch Peptid-Peptid-Interaktionen imitiert werden können und damit als Werkzeuge für zukünftige Analysen zur Verfügung stehen. Peptide können demzufolge zur Aufklärung der molekularen Details des HIV-1-Eintritts in die Zelle verwendet werden und haben das Potential, als neue Medikamente und Impfstoffe zu dienen.