Die Rolle des Ubiquitin-Proteasom-Systems in späten Prozessen der Replikation von Humanen Immundefizienzviren
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A main subject of this work was focused on the ubiquitin-protasome-system (UPS), which adopts important functions in the assembly and budding of HIV-1. In this context, Tsg101 was the first factor found, playing an important role in the late processes of HIV-1 replication. Tsg101 directly interacts with the PTAP-sequence of the p6 domain of the HIV-1 Gag precursor and supports the budding of HIV-1 as a component of the ESCRT-complex. The RING-finger ubiquitin-ligase Tsg101 associated ligase (Tal) was described as the budding factor regulator for Tsg101. Unlike in the previous publication from Amit et al. (Amit et al., 2004), only a modest effect on the budding of HIV-1 could be ascertained by knockdown of Tal-mRNA with siRNA. However, the infectivity of progeny virions was clearly increased. In overexpression studies with wild-type Tal or its transdominant negative RING-finger mutant (Tal-C675A-HA) a slight increase in virus release and an elevated infectivity was demonstrated. Similarly to the already published results, no differences could be found in the budding of virions in cells overexpressing wild-type Tal or the Tal-C675A-HA mutant. Another important protein in the intracellular transports of Gag assembly structures to the site of budding is the TGN-associated RING-finger ubiquitin-ligase Plenty of SH3s (POSH). In this work we were able to show that POSH governs important function in budding and production of infectious virus particles. Using siRNA knockdown of gene expression of POSH resulted in reduced virus release in vitro. The infectivity of the produced progeny virions was greatly decreased after POSH knockdown. Additionally, an enhanced induction of apoptosis in HIV-1 infected cells could be observed after POSH knockdown, which was neither depending on Nef, Vpu nor Env. In overexpression studies of the POSH-ligase or its transdominant negative RING-finger mutant, an increased virus release and an increased infectivity of the produced virions could be determined. This phenomenon depends on the RING-finger domain of the POSH-ligase. The second subject of this work was to verify whether HIV-1 infected patients produce anti-p6 antibodies and whether the specific seroconversion to anti-p6 antibodies is of clinical relevance. The binding domain for Tsg101 is located at the N-terminus of p6; the C-terminus consists of a further L-domain motive for AIP/ALIX. Tsg101 and AIP/ALIX are known to be important factors for virus release. A p6-ELISA, which was established in this work, showed, that 20% of the tested persons display a seroconversion to anti-p6 antibodies. With synthetic peptide fragments we were able to demonstrate, that human anti-p6 antibodies, which are present in human plasmas, were mainly directed to the C-terminal region of the p6 protein. Antibodies specific for the N-terminal region, which comprises the PTAP-sequence, exist only in a small portion of the patients. A p6-stripe western blot was developed to additionally confirm the positive reaction in the p6-ELISA. Only 50% of the plasmas tested positive in the p6-ELISA also reacted positive in the immunoblot with synthetic peptide as antigen. A western blot with viral peptide confirmed 80% of the p6-ELISA positives. In a retrospective study of the patients’ clinical parameters it became obvious that the seroconversion to the production of anti-p6 antibodies represents a late process in the HIV-1 infection and is independent from the treatment with inhibitors of the HIV-1 protease. Further clinical parameters which were examined did not show any correlation with the presence of the anti-p6 antibodies. The application of anti-p6 antibodies in patient’s samples as prognostic markers and/or for the diagnosis of a successful therapy could not be clarified in this work. However, it was important to establish methods for the detection of anti-p6 antibodies to investigate a possible clinical relevance of the seroconversion to anti-p6 antibodies in the future. To summarize, the molecular functions of various factors of the UPS in the late process of the HIV-1 replication were examined. It was shown that the ubiquitin-ligases Tal and POSH are important for virus release. Further, it was demonstrated that p6, as an immediate viral target of the UPS, causes a considerable humoral immune response in HIV-1 infected persons.
Abstract
Ein Schwerpunkt dieser Arbeit befaßte sich mit Proteinen des Ubiquitin-Proteasom-System (UPS), die wichtige Funktionen in der Assemblierung und Freisetzung von HIV-1 ausüben. Als erster Faktor des UPS, welcher in späten Prozessen des HIV-1 Replikationszykluses eine wichtige Rolle spielt, wurde Tsg101 gefunden. Tsg101 interagiert dabei direkt mit der PTAP-Sequenz der p6-Domäne des HIV-1 Gag Vorläuferproteines und unterstützt als Komponente des ESCRT-Komplexes das budding von HIV-1. Als Regulator des budding-Faktors Tsg101 wurde die RING-Finger Ubiquitinligase Tsg101 associated ligase (Tal) beschrieben. In der vorliegenden Arbeit konnte durch Herunterregulation der Tal-mRNA mit siRNA Molekülen im Unterschied zu der vorausgegangenen Publikation von Amit et al. (Amit et al., 2004) nur ein geringer Effekt auf das budding von HIV-1 festgestellt werden. Die Infektiösität der Nachkommenviren war jedoch deutlich erhöht. In Überexpressionsstudien mit Wildtyp Tal oder deren transdominant negativer RING-Finger Mutante (Tal-C675A-HA) wurde eine geringe Erhöhung in der Virusfreisetzung und eine verstärkte Infektiösität festgestellt. Identisch zu den bereits publizierten Ergebnissen konnte nach Überexpression der Tal-C675A-HA Mutante kein Unterschied im budding zu dem Wildtyp Tal festgestellt werden. Ein weiteres wichtiges Protein für den intrazellulären Transport von Gag-Assemblierungsstrukturen zum Ort der Virusfreisetzung stellt die TGN-assoziierte RING-Finger Ubiquitinligase Plenty of SH3s (POSH) dar. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, das POSH wichtige Funktionen in der Virusfreisetzung und Bildung infektiöser HIV-1 Viruspartikel ausübt. Eine siRNA vermittelte Herunterregulation der Genexpression von POSH führte zu einer verminderten Virusfreisetzung in Zellkultur. Die Infektiösität gebildeter Nachkommenviren war nach POSH knockdown stark reduziert. Zusätzlich konnte nach POSH knockdown eine verstärkte Apotoseinduktion in HIV-infizierten Zellen beobachtet werden, die weder Nef, Vpu noch Env abhängig war. In Überexpressionsstudien der POSH-Ligase oder deren transdominant negativer RING-Finger Mutante wurden verstärkte Virusfreisetzungen und erhöhte Infektiösität in den gebildeten Virionen festgestellt. Dies war abhängig von der RING-Finger Domäne der POSH-Ligase. Der zweite Schwerpunkt hinsichtlich der Untersuchungen zum UPS galt der Überprüfung, inwieweit HIV-1 infizierte Patienten anti-p6 Antikörper entwickeln und ob diese anti-p6 spezifische Serokonversion eine klinische Relevanz besitzt. In p6 befindet sich N-terminal die Bindedomäne für Tsg101, C-terminal ist ein weiteres L-Domänenmotiv für AIP/ALIX lokalisiert. Tsg101 und AIP/ALIX sind als wichtige Faktoren der Virusfreisetzung bekannt. Ein in dieser Arbeit etablierter p6-ELISA zeigte, dass ca. 20 Prozent des getesteten Probandenspektrums eine Serokonversion zu anti-p6 Antikörpern aufwiesen. Epitopcharakterisierungen mit synthetischen Peptidfragmenten zeigten, dass in den humanen Plasmen anti-p6 Antikörper vorlagen, die hauptsächlich gegen den C-terminalen Bereich von p6 gerichtet waren. Antikörper gegen den N-terminalen Bereich, der die PTAP-Sequenz umfaßt waren nur bei einem geringen Teil der Patienten vorhanden. Als zusätzlichen Bestätigungstest der Positivreaktion aus dem p6-ELISA wurde ein p6-Immuno-Streifenblot entwickelt. Nur 50% der im ELISA anti-p6 positiv getesteten Plasmen zeigten mit synthetischem Peptid als Antigen eine Bestätigungsreaktion im Immunoblot. Mit viralem Peptid konnte für 80 % ein positiver Bestätigungstest durchgeführt werden. In der retrospektiven Studie der klinischen Patientenparameter wurde deutlich, dass die Serokonversion zur Entwicklung von anti-p6 Antikörper einen späten Prozeß in der HIV-1 Infektion darstellt und von der Behandlung mit Inhibitoren der HIV-Protease unabhängig war. Weitere untersuchte klinische Parameter wiesen keine Korrelation mit der Anwesenheit der anti-p6 Antikörper auf. Die Funktion von anti-p6 Antikörpern in humanen Patientenproben als Prognosemarker zur Einschätzung des Krankheitsverlaufes und/oder als Therapieerfolges konnte in dieser Arbeit noch nicht geklärt werden. Dennoch war es wichtig, Methoden zur Detektion von anti-p6 Antikörpern zu etablieren um zukünftig die mögliche klinische Relevanz der Serokonversion zu anti-p6 Antikörpern zu untersuchen. Zusammenfassend wurden in der vorliegenden Arbeit die molekularen Funktionen von verschiedenen Faktoren des UPS in späten Prozessen der HIV-1 Replikation untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Ubiquitinligasen Tal und POSH in der Virusfreisetzung wichtig sind. Ebenfalls konnte erstmals gezeigt werden, dass p6 als ein unmittelbares Target des UPS, eine wesentliche humorale Immunantwort bei HIV-1 infizierten auslöst.