Charakterisierung eines neuen regulatorischen Elements im VH-Cluster und dessen potentieller Einfluss auf die VDJ-Rekombination
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Abstract
VDJ recombination is considered to be regulated by lineage and stage specific changes in accessibility of the loci to the RAG-recombinase. Accessibility is expected to correlate with certain histone modifications such as acetylation (e.g. H3Ac) or methylation of H3 on lysine 4 (H3K4Me2/3). Previous studies in our lab revealed three regions in the intergenic part of the distal VH cluster (IVARs), which are associated with high levels of active chromatin marks (H3Ac and H3K4Me2/3) only in pro-B cells but not in pro-T cells. It is also known that VDJH recombination is accompanied by sense and antisense transcription, however, little is known about the function and origin of the antisense transcripts. Since one IVAR (IVAR #3) showed promoter activity in antisense orientation, it was analysed in more detail. Three transcription start sites at the IVAR #3 element were found by 5´RLM RACE. The corresponding steady state transcripts could only be found in pro-B and not in pro-T cells as shown by RT real-time PCR. Furthermore, these transcripts are downregulated after the pro-B cell stage in B-lymphocyte development. Therefore, it was assumed that the IVARs play a role in VH -> DJH recombination of distal VH gene segments. To elucidate the role of the IVARs in VH -> DJH recombination, gene-targeted mice were created, in which the IVAR #3 element was deleted. PCR plus subsequent Southern blot analysis showed a tendency for reduced recombination frequency of distal VH genes of the J558-VH gene family in those mice. The reduction in distal J558 VH gene usage seems to be accompanied by an increase in proximal 7183 VH gene usage. Deep Sequencing analysis showed that the observed reduction in usage of distal VH genes doesn’t correlate with the proximity to the IVAR #3 element, although the J558 VH genes adjacent to the IVAR #3 are found significantly reduced. Compared to WT-mice J558 VH gene recombinations of KO-mice have a higher tendency to be productively rearranged. The observed tendencies in the altered usage of distal VH gene segments in these gene-targeted mice indicate an important functional role of the IVAR-elements during VDJH recombination.
Abstract
Die VDJ-Rekombination wird durch die zelltyp- und stadiumspezifische Zugänglichkeit der zu rekombinierenden Loci für die RAG-Rekombinase reguliert. Zugänglichkeit korreliert mit bestimmten Histonmodifikationen wie Azetylierung (z.B. am Histon 3 (H3Ac)) oder Methylierung von Lysinen (z.B. am Lysin 4 (K4) von H3 (H3K4Me2/3)). Vorausgegangene Untersuchungen der Arbeitsgruppe haben im intergenen Bereich der distalen VH-Region drei Regionen (IVAR-Elemente) aufgezeigt, die in proB-Zellen, jedoch nicht in proT-Zellen mit aktiven Chromatinmodifikationen angereichert sind. Zudem ist bekannt, dass VDJH-Rekombination mit sense- und antisense-Transkription einhergeht. Bisher ist jedoch wenig über die Funktion und den Ursprung der antisense-Transkripte bekannt. Da ein IVAR-Element (IVAR #3) eine Promotoraktivität in antisense-Orientierung aufwies, wurde es näher untersucht. Mittels 5´RLM-RACE konnten drei Transkriptionsstartpunkte am IVAR #3-Element nachgewiesen werden. Durch RT real-time PCR konnte gezeigt werden, dass die zugehörigen Transkripte nur in proB- und nicht in proT-Zellen vorhanden sind. Zudem werden diese Transkripte nach dem proB-Zellstadium herunterreguliert. Aus diesem Grund wird vermutet, dass die IVAR-Elemente eine Rolle in der VH nach DJH-Rekombination distaler VH-Gensegmente spielen. Um die Funktion der IVAR-Elemente für die VH nach DJH-Rekombination zu analysieren, wurden mittels gene-targeting Mäuse erzeugt, die eine IVAR #3-Deletion tragen. PCR mit anschließenden Southern Blot Analysen haben bei diesen Mäusen eine Tendenz für eine reduzierte Verwendung distaler J558-VH-Gensegmente beobachten lassen. Die Reduktion in der Verwendung distaler J558-VH-Gensegmente wird durch eine Zunahme in der Verwendung proximaler 7183-VH-Gensegmente begleitet. Deep Sequenzing Analysen haben gezeigt, dass die beobachtete reduzierte Verwendung distaler VH-Gensegmente nicht mit der Nähe zum IVAR #3-Element korrelierte, auch wenn die dem IVAR #3 direkt benachbarten J558-VH-Gensegmente signifikant reduziert vorlagen. Im Vergleich zu WT-Mäusen waren die J558-VH-Umlagerungen von KO-Mäusen verstärkt produktiv umgelagert. Die beobachtete veränderte Nutzung distaler VH-Gensegmente in KO-Tieren deutet auf eine wichtige regulative Rolle der IVAR-Elemente während der VDJH-Rekombination hin.