Immunmonitoring und Immuntherapie mit HIV-spezifischen mRNAs
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A major focus of the thesis was the production and characterization of viral mRNA constructs for immunomonitoring of T-cells and for the development of RNA-based vaccines. I could demonstrate that electroporation of PBMC with autologous HIV-1-specific mRNA allows a rapid and efficient analysis of the T-cell responses against the autologous virus. Several HIV-1-specific mRNAs encoding Gag, Nef and Env were generated and successfully used for electroporation of PBMC in this thesis. Thereby, a rapid and efficient expression of mRNA-encoded proteins in all subpopulations of PBMC was demonstrated whereat the protein expression was detected up to six days after electroporation. The mRNA-encoded HIV-1 proteins were highly immunogenic in vitro and triggered the secretion of γ-IFN and TNF-α. It was shown that the release of γ IFN was induced by HIV-1-specific T-cells. In addition to the immunogenicity the functionality of the mRNA-encoded HIV-1 proteins was also demonstrated. The expression of CD4, CXCR4 and HLA-I on the cell surface was clearly reduced by mRNA-encoded Nef proteins. Moreover, mRNA-encoded HIV 1 proteins could activate CD8+ T-cells in vitro. The mRNA-encoded HIV-1 proteins can be used as efficient antigens for monitoring of T-cell responses in HIV-1-infected patients. They induced stronger CTL responses compared to recombinant vaccinia viruses and similar immune reactions as peptide pools. Using autologous HIV-1-specific mRNAs the immune response against autologous viral proteins was compared to the immune response against heterologous viral proteins. In five of ten cases, the autologous viral proteins induced stronger immune responses than proteins of HIV-1 reference viruses, demonstrating that conventional monitoring using heterologous antigens frequently underestimates the magnitude of the CTL responses against the autologous virus. In two cases, the T-cell response against the heterologous viral antigen exceeded the response against the autologous virus which could be explained by CTL escape mutations in the autologous viral sequence. This observation underlines the important role of CTL escape and it demonstrates that the use of heterologous antigens can also overestimate the HIV-1-specific immune responses. Besides the establishment of a novel efficient tool for monitoring the T-cell responses against autologous viruses, mRNA-electroporation can also address important issues concerning the use of HIV-1-specific mRNAs as therapeutic vaccines. It could be confirmed that mRNA-encoded proteins Gag and Nef induced better immune responses than Env and that they are suitable antigens for vaccination. However, it was shown that combined application of gag and nef mRNAs causes a dramatic loss of the induced immune responses in PBMC due to the HLA-I reduction by Nef protein. Moreover, the experiments provided interesting insights about the hierarchy of CTL epitopes and the efficiency of epitope presentation which are useful for the design of vaccines. There are several sequence homologies between HIV-1 and the human genome that could potentially lead to autoimmune reactions after vaccination. Therefore, I investigated the cross-recognition of the human proteins DAO and Fat3 by Nef-specific CTL. I observed cross-recognition of DAO and Fat3-derived peptides by Nef-specific CTL, but I could not detect CTL recognition of cell lines expressing the Fat3 protein. This is suggesting that the cross-reactive peptides are not processed from these proteins. During my thesis I could define three new CTL epitopes in Gag and two in Nef. As HIV-1 Nef downregulates HLA-A and –B molecules from the cell surface, there is growing interest in HLA-C-restricted CTL responses. Therefore, I investigated the recognition of a HLA-Cw07-restricted CTL epitope in Nef in a cohort of HIV-1-infected patients. I could demonstrate that this epitope is targeted by approximately half of the HLA-Cw07-positive patients. As mRNA-electroporation is not suitable for in vivo application, I investigated alternative transfection methods. The mRNA could be transferred into cells by FuGENE, but not by chitosan, atelocollagen or the HIV-1 protein Tat. In my thesis, the electroporation of HIV-1-specific mRNAs in PBMC could be established as a novel, efficient tool for immunomonitoring. The use of autologous viral mRNA allows also the determination of the T-cell response against the autologous virus and the analysis of function of the viral proteins. In addition, the results provide useful information for the development of efficient mRNA-based vaccines for therapy and prevention of HIV 1-infection.
Abstract
Ein wesentlicher Schwerpunkt der Promotionsarbeit waren Experimente zur Entwicklung von viralen mRNA-Konstrukten zum Immunmonitoring von T-Zellen und zur Entwicklung von Vakzinen. In der vorgelegten Dissertation wurden HIV-1-spezifische mRNAs generiert und erfolgreich zur Elektroporation in PBMC eingesetzt. Es konnte dabei gezeigt werden, dass die Elektroporation von PBMC mit autologen HIV-1-spezifischen mRNAs eine schnelle und effiziente Analyse der T-Zellantworten gegen das eigene HI-Virus erlaubt. Es konnte eine schnelle und effiziente Expression der mRNA-kodierten Proteine in allen Subpopulationen der PBMC nachgewiesen werden, wobei die Proteinexpression bis zu sechs Tage nach Elektroporation detektiert werden konnte. Die mRNA-kodierten HIV 1-Proteine waren in vitro hoch immunogen und lösten die Sekretion von γ-IFN und TNF-α aus. Dabei zeigte sich, dass die γ-IFN Freisetzung von HIV-1-spezifischen T-Zellen verursacht wird. Neben der Immunogenität wurde auch die Funktionalität der mRNA-kodierten HIV-1-Proteine belegt. Denn die Expression der Moleküle CD4, CXCR4 und HLA-I auf der Zelloberfläche wurde durch die mRNA-kodierten Nef-Proteine deutlich reduziert. Außerdem konnten mRNA-kodierte HIV-1-Proteine CD8+ T-Zellen aktivieren. Die mRNA-kodierten HIV-1-Proteine können als alternative Antigene für das Monitoring von T-Zellantworten bei HIV-1-infizierten Patienten eingesetzt werden. Sie induzierten stärkere CTL-Antworten wie rekombinante Vaccinia-Viren und ähnliche Immunreaktionen wie Peptid-Pools. Im Vergleich zu einzelnen HIV-1-Peptiden rufen sie jedoch geringere T-Zellantworten hervor. Durch den Einsatz autologer HIV-1-spezifischer mRNAs konnten die Immunantworten gegen autologe Virusproteine detektiert und mit denen gegen heterologe Virusproteine verglichen werden. In fünf von zehn Fällen lösten die autologen viralen Proteine stärkere Immunantworten aus als Proteine von HIV-1 Referenzviren. Folglich konnte bewiesen werden, dass die im Monitoring ermittelten Immunreaktionen häufig unterschätzt werden, da mit den Standard-Methoden die CTL-Antworten gegen das eigene Virus nicht quantifiziert werden können. In zwei Fällen wurde eine deutlich geringere T-Zellantwort gegen das autologe Virusprotein gemessen, was auf CTL Fluchtmutanten in der autologen Virussequenz zurückgeführt werden konnte. Demzufolge kann es auch zur Überschätzung der Immunantworten beim Standard-Monitoring kommen. Neben der Etablierung einer neuen, effizienten Methode zum Monitoring von T Zellantworten gegen autologe Viren diente die mRNA-Elektroporation auch zur Aufklärung wichtiger Fragestellungen, die den Einsatz HIV-1-spezifischer mRNAs als therapeutische Vakzine betreffen. Es konnte bestätigt werden, dass die mRNA-kodierten Proteine Gag und Nef in HIV-1-infizierten Patienten besser erkannt wurden als Env. Allerdings konnte gezeigt werden, dass die gleichzeitige Verabreichung von gag und nef mRNA zu einem drastischen Verlust der induzierten Immunantworten in PBMC aufgrund der HLA-I-Reduktion durch das Nef-Protein führt. Zudem wurden klare Hinweise erhalten, aus welchen Epitopen eine optimale mRNA-Vakzine bestehen soll, da mit dem entwickelten Assay die CTL-Epitop-Hierarchie studiert werden konnte. Außerdem wurde von mir untersucht, ob Kreuzreaktionen von HIV-1-spezifischen CTLs mit humanen Proteinen existieren, die zu Nebenwirkungen bei einer mRNA-Vakzinierung führen könnten. Dazu wurden Nef-spezifische CTL auf die Erkennung von Peptiden aus den humanen Proteinen DAO und Fat3 getestet. Dabei zeigte sich eine deutliche Erkennung der Peptide, jedoch keine Erkennung von Fat3-exprimierenden Zelllinien. Im Rahmen der Promotion konnte ich mehrere CTL-Epitope neu definieren, darunter drei neue CTL-Epitope in Gag und zwei in Nef. Da HIV-1 Nef HLA-A und –B, nicht jedoch HLA-C von der Zelloberfläche herabreguliert und damit die HIV-1-spezifische CTL-Antwort inhibiert, gewinnt die HLA-C-restringierte CTL-Antwort an Bedeutung. Daher wurde eine systematische Analyse der Erkennung eines konservierten HLA-Cw-restringierten CTL in Nef durchgeführt, wobei eine Erkennung des Epitops von ca. der Hälfte der untersuchten HLA-Cw*07-positiven HIV-1-Patienten festgestellt werden konnte. Da bei einer in vivo Applikation die mRNA-Elektroporation eher ungeeignet ist, wurde nach alternativen Transfektionsmethoden gesucht. Dabei konnte mRNA mit Hilfe von FuGENE in die Zelle transfiziert werden, wohingegen Chitosan, Atelokollagen und das HIV-1 Tat-Protein nicht in der Lage waren, mRNA in die Zelle einzuschleusen. Damit konnte in der vorgelegten Arbeit die Elektroporation von HIV-1-spezifischen mRNAs in PBMC als neue effiziente Methode zum Immunmonitoring etabliert werden. Die Verwendung autologer viraler mRNA erlaubt zusätzlich die Bestimmung der T-Zellantwort gegen das eigene Virus. Darüber hinaus eignet sich die etablierte Technik, um virale mRNAs als Vakzine zur Therapie und Prävention der HIV-1-Infektion zu entwickeln.