Untersuchung der Siglec-G Expression und funktionelle Analyse der Ligandenbindungsdomäne
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Siglec-G is a transmembrane protein of the Siglec family, which mediates the inhibition of the BCR-signal on B1a cells. With its aminoterminal V-set immunoglobulin domain Siglec-G is able to bind α2,3 and α2,6-linked sialic acids. A positively charged residue of the ligand binding domain is directly involved in the ligand-binding. It was so far not known, whether the ligand-binding of Siglec-G is important for its biological function. Furthermore the Siglec-G expression pattern was only known from RNA-expression data, and a direct proof of Siglec-G surface expression was missing, because there was no monoclonal anti-Siglec-G antibody available. By creating a mouse line in which the Siglec-G ligand-binding is disrupted due to the mutation of the essential arginine-residue (Siglec-G R120E) we were able to analyse the role of the Siglec-G ligand-binding for the first time. The loss of the ligand-binding in Siglec-G R120E mice leads to a massive increase of the B1a cell population of the spleen and the peritoneal cavity. The reasons for this enhanced B1a cell population are similar to these of Siglec-G deficient mice. B1a cells of Siglec-G R120E mice show a changed BCR-repertoire, which probably leads to an increased selection of bone marrow derived B cells into the pool of B1a cells. Additionally, peritoneal cavity B1a cells of the Siglec-G R120E mice survive better in vitro. A result of this enlarged B1a cell population is presumably the increased level of serum IgM antibodies. Furthermore, the B1a cells of the Siglec-G R120E mice show an increased Calcium influx after BCR stimulation. We also looked for the ligand specificity of Siglec-G in comparison to its B2 cell homolog CD22. It was shown that Siglec-G on peritoneal cavity cell exclusively binds to α2,6 linked sialic acids. For the analysis of the surface expression of Siglec-G we generated a monoclonal anti-Siglec-G antibody. With this we showed that Siglec-G is expressed throughout the B cell development. The Siglec-G expression on peritoneal cavity B1a cell is slightly higher than the expression on B1b/B2 cells. In the spleen there is no difference between the Siglec-G expression on B1a or B2 cells. Moreover, Siglec-G is also expressed on lymphoide dendritic cells. In summary, these results show no strong differences in the Siglec-G expression between B1 and B2 cells but an essential role of the ligand-binding domain for the biological function of Siglec-G on B1 cells.
Abstract
Siglec-G ist ein Transmembranprotein aus der Siglec-Familie, dessen biologische Funktion in der Inhibition des BZR-vermittelten Signals auf B1a-Zellen besteht. Mit Hilfe der amino-terminalen V-set Immunoglobulin Domäne kann Siglec-G α2,3 und α2,6-verknüpfte Sialinsäuren binden. Beteiligt an der Ligandenbindung ist hierbei besonders ein positiv geladener Argininrest in der Ligandenbindedomäne. In wieweit die Ligandenbindung eine wichtige Rolle bei der biologischen Funktion von Siglec-G spielt, war bisher völlig unklar. Weiter war die Siglec-G Expression bisher lediglich aufgrund von RNA-Expressionsprofilen gezeigt, ein direkter Nachweis für die Oberflächenexpression von Siglec-G konnte aufgrund eines fehlenden monoklonalen Antikörpers bisher nicht gezeigt werden. Durch die Herstellung einer Mauslinie, in der die Siglec-G Ligandenbindung durch eine Mutation des essentiellen Argininrests defekt war (Siglec-G R120E), konnte erstmals die biologische Funktion der Ligandenbindung von Siglec-G untersucht werden. Der Verlust der Ligandenbindung in Siglec-G R120E Mäusen führte in der Population der B1a-Zellen der Milz und des Peritoneums zu einer massiven Vergrößerung dieser Population. Die Gründe für diese expandierte B1a-Zell Population sind ähnlich wie in den Siglec-G-defizienten Mäusen. So zeigen die B1a-Zellen der Siglec-G R120E Mäuse ein verändertes B-Zell-Rezeptor Repertoire, was vermutlich zu einer vermehrten Selektion von adulten Knochenmarkszellen in die B1a-Zell Population führt. Außerdem überleben die peritonealen B1a-Zellen der Siglec-G R120E Mäuse besser in vitro. Eine Folge der vergrößerten B1a-Zell Population ist vermutlich der erhöhte Serum IgM Spiegel in diesen Mäusen. Weiter zeigen die B1a-Zellen der Siglec-G R120E Mäuse ein verstärktes Calciumsignal nach BZR-Stimulierung. Untersucht wurde außerdem die Ligandenspezifität von Siglec-G im Vergleich zum B2-Zell Homolog CD22. Hierbei zeigt sich, dass α2,6-verknüpfte Sialinsäuren auf peritonealen B-Zellen ausschließlich von Siglec-G gebunden werden. Zur Analyse der Siglec-G Expression wurde ein monoklonaler anti-Siglec-G Antikörper hergestellt. Damit konnte gezeigt werden, dass Siglec-G bereits während der B-Zellentwicklung exprimiert wird. Weiter ist die Siglec-G Expression auf peritonealen B1a-Zellen etwas höher als auf B1b/B2-Zellen. In der Milz gibt es zwischen B1 und B2-Zellen keinen Unterschied in der Siglec-G Expression. Außerdem wird Siglec-G auch auf lymphoiden Dendritischen Zellen exprimiert. Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse keine gravierenden Unterschiede in der Siglec-G Expression zwischen B1 und B2-Zellen aber eine essentielle Rolle der Ligandenbindungsdomäne für die biologische Funktion von Siglec-G auf B1-Zellen.