Ex vivo Isolation und Charakterisierung von CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen unter spezifischer Immuntherapie bei Typ I-Allergie auf Inhalationsallergene
Language
de
Document Type
Doctoral Thesis
Issue Date
2011-07-19
Issue Year
2011
Authors
Maronna, Andreas
Editor
Abstract
- Background and aims Aim of this paper was to establish ex vivo methods to examine the role of CD4+CD25+ regulatory T cells in induction of allergen-specific tolerance by immunotherapy. This was an experimental study following the clinical course during immunotherapy ex vivo in birch pollen allergic patients. 2. Methods (patients, material, methods of examination) Tyrosine-adsorbed, chemically modified allergen extracts of birch pollen were used as vaccines. MPL®, Monophosphoryl Lipid A®, a detoxified lipopolysaccharide produced from the endotoxin of Salmonella minnesota was used as an adjuvant. The component-specific profile of senzitization of each patient was determined by IgE-immunoblot on blotted natural pollen extracts. At defined points in time during immunotherapy blood was taken to isolate PBMC and sort by MACS®. From these specimens the allergen-specific (stimulation with rBet v 1 loaded dendritic cells) and nonspecific (stimulation with anti-CD3/CD28-antibody) proliferative potential of CD4+ bulk T cells, CD4+CD25+, and CD4+CD25- T cells, as well as the inhibitory potential of CD4+CD25+ T cells and the released cytokine pattern of the subsets of CD4+ bulk T cells, CD4+CD25+, and CD4+CD25- T cells were analysed. The fraction of CD4+CD25+ T cells in PBMC was obtained by FACS. Serum was examined for allergen-specific IgE, IgG und IgG4 against the allergens contained in natural birch pollen extract and recombinant single allergens of birch (rBet v 1, rBet v 2, rBet v 4) during immunotherapy. 3. Results and observations CD4+ bulk, CD4+CD25+, and CD4+CD25- T cells were more proliferative during antigen-specific stimulation with rBet v 1-loaded mature dendritic cells (mDC) than during antigen-nonspecific stimulation with unloaded mDC. This indicates an antigen-specific effect of Bet v 1 on CD4+ bulk, CD4+CD25+, and CD4+CD25- T cells and their ability to proliferate. By stimulation with mDC (unloaded or loaded with rBet v 1) the CD4+CD25- T cells proliferated stronger than the CD4+ bulk T cells still owning the natural fraction of CD4+CD25+ T cells. The finding of reduced proliferation of CD4+ bulk T cells supports the ability of CD4+CD25+ T cells to inhibit proliferation. The low proliferative activity of CD4+CD25- T cells characterizes them as regulatory T cells. The fraction of CD4+CD25+ T cells in PBMC increased during immunotherapy occurring only in patients mono-sensitized against Bet v 1 (major allergen of birch) and not in patients also sensitized against minor allergens of birch (poly-sensitized). The ability of CD4+CD25+ T cells to inhibit proliferation of CD4+CD25- T cells was shown to be constant in nonspecifically stimulated approaches during immunotherapy in mono- and poly-sensitized patients. A short-term increase of IL 10 was seen in nonspecifically stimulated approaches of coculturing CD4+CD25- and CD4+CD25+ T cells (1:1) during immunotherapy in mono-sensitized patients. De novo sensitization (allergen-specific IgE) against allergens in natural birch pollen extract which had not been recognized by the respective individual at the beginning of the treatment were not observed during SIT. 4. Practical conclusion The results on increase, characteristics and effect of CD4+CD25+ regulatory T cells emphasize their pivotal meaning in development and treatment of allergic diseases which must be further studied. In commercially available vaccines so far only the concentration of major allergens is standardized. In consequence, patients who are exclusively sensitized against major allergens may have a greater benefit from immunotherapy. Future allergen vaccines based on recombinant allergens will allow the use of standardized minor allergens of clinical relevance in allergen vaccines to induce peripheral tolerance.
Abstract
- Hintergrund und Ziele Ziel der vorliegenden Arbeit war, Methoden und Versuchsansatz zur ex vivo Untersuchung der Rolle CD4+CD25+ regulatorischer T Zellen bei der Induktion Allergen-spezifischer Toleranz durch spezifische Immuntherapie (SIT) zu etablieren. Es handelte sich um eine experimentelle Studie, bei der der klinische Verlauf der SIT ex vivo bei Birkenpollenallergikern verfolgt wurde. 2. Methoden (Patienten, Material, Untersuchungsmethoden) Als Impfstoff wurden tyrosin-adsorbierte, chemisch modifizierte Allergenextrakte der Birke verwendet, wobei als Adjuvans MPL®, Monophosphoryl Lipid A®, ein detoxifiziertes Lipid aus dem Endotoxin von Salmonella minnesota eingesetzt wird. Das komponentenspezifische Sensibilisierungprofil eines jeden Patienten wurde im IgE-Immunoblot auf aufgetrennten natürlichen Pollenextrakten bestimmt. Zu definierten Zeitpunkten während der SIT wurden den Patienten Blutproben entnommen, um PBMC zu isolieren und mittels MACS® weiter aufzutrennen. Aus diesen Proben wurde das Allergen-spezifische (Stimulation durch rBet v 1 beladenen dendritischen Zellen) und unspezifische (Stimulation durch anti-CD3/CD28-Antikörper) proliferative Potential von CD4+ bulk T Zellen, CD4+CD25+ und CD4+CD25- T Zellen, sowie das inhibitorische Potential von CD4+CD25+ T-Zellen und die Zytokinsekretionsmuster der Subsets der CD4+ bulk T Zellen, CD4+CD25+ und CD4+CD25- T Zellen analysiert. Der Anteil der CD4+CD25+ T Zellen an den PBMC wurde mittels FACS-Ana¬ly¬sen bestimmt. Das Allergen-spezifische Immunglobulin-Muster (IgE, IgG und IgG4) gegen natürlichen Birkenpollenextrakt und rekombinante Einzelallergene der Birke (rBet v 1, rBet v 2, rBet v 4) wurde bestimmt. 3. Ergebnisse und Beobachtungen Es konnte gezeigt werden, dass die Zellpopulationen CD4+ bulk, CD4+CD25+, CD4+CD25- T Zellen eine stärkere Proliferation bei Antigen-spezifischer Stimulation mit rBet v 1-beladenen reifen dendritischen Zellen (mature dendritic cells, mDC) zeigen im Vergleich zu unbeladenen reifen dendritischen Zellen. Dies kann als Antigen-spezifischer Effekt von rBet v 1 auf die Populationen CD4+ bulk, CD4+CD25+, CD4+CD25- T Zellen und deren Proliferationsfähigkeit interpretiert werden. Es konnte ebenso aufgezeigt werden, dass bei der Stimulation mittels reifer dendritischer Zellen (unbeladen oder mit rBet v 1 beladen) die Population der CD4+CD25- T Zellen durchweg deutlich stärker proliferiert als die CD4+ T Zellen, die den natürlichen Anteil CD4+CD25+ T Zellen besitzen. Diese reduzierte Proliferationsrate der CD4+ Zellen bestätigt die Fähigkeit der CD4+CD25+ Zellen zur Proliferationsinhibition, die selbst kaum proliferieren, was sie ebenfalls als regulatorische CD4+CD25+ T Zellen charakterisiert. Des Weiteren kam es zu einem Anstieg des Anteils der CD4+CD25+ T Zellen an den Gesamt-PBMC im Verlauf der SIT, wobei dies nur bei den Patienten auftrat, die ausschließlich auf das Hauptallergen der Birke Bet v 1 sensibilisiert waren („Mono-Sensibilisierte“), nicht bei den Patienten, die zusätzlich auf weitere Minorallergene der Birke sensibilisiert waren („Poly-Sensibilisierte“). Die Fähigkeit der CD4+CD25+ T Zellen zur Proliferationsinhibition der CD4+CD25- T Zel¬len zeigte sich in den Ansätzen mit unspezifischer Stimulation im Verlauf der SIT bei beiden Patientengruppen konstant. Darüber hinaus zeigte sich, wie in der Literatur vorbeschrieben, ein kurzfristiger Anstieg der IL 10-Werte in den unspezifisch stimulierten Regulationsansätzen aus gleichen Teilen CD4+CD25- und CD4+CD25+ T Zellen im Verlauf der SIT bei den „Mono-Sensibilisierten“. Neusensibilisierungen (de novo Allergen-spezifische IgE-Antikörper) auf im Gesamtextrakt enthaltene Allergene, auf die ein Individuum vor Behandlung nicht allergisch war, traten unter SIT nicht auf. 4. Praktische Schlussfolgerungen Die Ergebnisse bezüglich des Anstiegs, der Eigenschaften und der Effekte der CD4+CD25+ regulatorischen T Zellen deuten auf deren zentrale Bedeutung bei der Entwicklung und der Behandlung allergischer Krankheiten hin, die in Anschlussuntersuchungen weiter verfolgt werden sollen. Da derzeit in kommerziell erhältlichen Impfstoffen lediglich die Konzentration von Hauptallergenen, bei Birke Bet v 1, standardisiert ist, lässt dies erwarten, dass Patienten, deren individuelles Sensibilisierungsprofil ausschließlich das/die in der Allergie-Vakzine standardisiert vorliegende(n) Allergen(e) umfasst, in höherem Maße von der SIT profitieren. Zukünftige Allergievakzine, die auf rekombinanten Allergenen basieren, bieten die Möglichkeit, standardisiert auch Minorallergene zur peripheren Toleranzentwicklung in Vakzinen einzusetzen.