Funktionelle Analyse des HIV-1 Rev-Proteins mit heterlogen Exportsignalen
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Backround and goals: In eukaryotic cells, the nucleus and cytoplasm are separated by the nuclear membrane. Cellular communication strictly depends on regulated nucleocytoplasmic transport through the nuclear pore complex (NPC), which is controlled by specific signals and transport factors. Active nuclear import is mediated by short stretches of basic amino acids, termed nuclear localization signals (NLS), interacting with import receptors, the so-called importins. The best characterized nuclear export signals (NESs) consist of a short leucine-rich stretch of amino acids and interact with the export receptor Exportin1/CRM1. Importantly, a variety of viruses also depend on the cellular transport machinery in order to optimize viral replication. This is exemplified during the life cycle of complex retroviruses, such as the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1). The HIV-1 Rev protein harbors a NLS as well as a CRM1-dependent NES, allowing the protein to shuttle between the nucleus and the cytoplasm. By means of its RNA-binding domain, Rev exports unspliced and singly spliced viral mRNAs into the cytoplasm, thereby allowing the efficient production of viral proteins required for efficient viral replication and pathogenesis. Various experimental studies, including microinjection of GFP (Green Fluorescent Protein)-tagged NES fusion proteins, showed that the export activity of NESs differ dramatically. Whereas the NES of the protein kinase inhibitor protein (PKI) mediates a fast export, the HIV-1 Rev NES displays medium activity and the NES of the adenovirus type 5 E1b-55k protein promotes only slow transport. However, it is not yet understood whether the NES-mediated specific export kinetics are capable to regulate the (patho)biological functions of their respective proteins. Also, whether NESs can be employed as kinetic tools to rationally modulate the biological activities of proteins remains to be demonstrated. Hence, these questions should be addressed by this study. Methods and results: Employing ectopic expression of Rev-(NES)-GFP fusion proteins, harboring heterologous NESs, their localization and trafficking was studied in living eukaryotic cells by fluorescence microscopy. These studies showed that Rev-(NES)-GFP fusions containing the “medium” Rev NES or the “slow” E1b-NES accumulated in the nucleus/nucleolus. Accumulation appears to be mediated by interaction with 5S rRNA, as treatment with Actinomycin D dissolved the nucleoli resulting in a cytoplasmic steady localization of these Rev-(NES)-GFP fusions. Notably, a Rev-(NES)-GFP fusions containing the “fast” PKI_NES accumulated in the cytoplasm, indicating that nuclear export is more efficient than import, which may be caused by enhanced affinity of the PKI_NES to CRM1. The observed kinetic transport difference was also translated into the biological activity of the respective Rev-(NES)-GFP fusions. CAT-reporter transactivation assays demonstrated that the Rev-PKI_NES-GFP displayed a higher Rev-dependent mRNA-transport activity compared to the Rev-Rev_NES-GFP protein, whereas the Rev-E1b_NES-GFP protein was inactive. Similar results were obtained when the Rev-(NES)-GFP proteins were tested in the context of the HIV-1 genome employing transfection assays. For this purpose, the Rev-(NES)-GFP coding regions were integrated into the nef region of the proviral cDNA expression cassette, in which the NES of the endogenous rev was inactivated by mutagenesis. However, infection experiments indicated that the generated viral particles were non-infectious, which may be caused by affecting the overlapping env-reading frame during rev NES inactivation in the proviral cDNA. Conclusions: The results of this study support the hypothesis that kinetic engineering by using NESs with different export activities appears to be applicable to modulate the kinetics as well as the biological activity of regulatory transport proteins. The rational application of NESs as kinetics tools may thus be used in gene therapeutic strategies to rationally modify biological effects executed by regulatory proteins. In the context of complex DNA or RNA viruses, kinetic engineering of viral transport proteins critically involved in viral replication and/or pathogenesis may be envisaged to attenuate viruses for novel biomedical applications, such as vaccination strategies.
Abstract
Hintergrund und Ziele: Das RNA-Transportprotein Rev des Humanen Immunodefizienz Virus Typ 1 (HIV-1) besitzt sowohl ein Import- (NLS) als auch ein Exportsignal (NES), womit es aktiv zwischen Zellkern und Zytoplasma hin- und herwandern („shutteln“) kann. Über seine RNA-Bindungsdomäne kann das Rev Protein un- bzw. einfach gespleißte HIV-1 mRNA binden und vom Zellkern in das Zytoplasma transportieren. Meist Leucin-reiche NESe scheinen zudem in der Lage zu sein, unterschiedliche charakteristische Transportkinetiken zu vermitteln. Anhand von Mikroinjektionsexperimenten mit GFP (Green Fluorescent Protein)-markierten NES-Fusionsproteinen konnten NESe kinetisch klassifiziert werden. Das NES des Proteinkinase-Inhibitor Proteins (PKI) vermittelt beispielsweise einen schnellen Kernexport, das HIV-1 Rev NES zeigt hingegen eine mittlere Export-Geschwindigkeit und das NES des Adenovirus Typ 5 E1b-55k Proteins vermittelt einen langsamen Export aus dem Zellkern. Bisher ist nicht verstanden, ob die durch die NESe vermittelten spezifischen Exportkinetiken die biologische Aktivität des jeweiligen Proteins zu beeinflussen vermögen, und ob letztere durch rationale Auswahl geeigneter NESe moduliert werden kann. Methoden: Expressionsplasmide von Rev-(NES)-GFP Fusionproteinen in Säugerzellen wurden mittels rekombinanter DNA-Techniken erstellt. Diese HIV-1 Rev-GFP Fusionproteine enthielten dabei neben dem HIV-1 wildtyp-Rev-NES mit einer intermediären Exportaktivität entweder das einen schnellen Export vermittelnde PKI-NES oder das langsame E1b-NES. Die Kopplung der HIV-1 Rev-Proteine mit dem autofluoreszierenden GFP erlaubt hierbei, die Verteilung und den Transport der Fusionsproteine in lebenden Säugerzellen mittels Fluoreszenzmikroskopie zu verfolgen. Die Kompetenz der Rev-Proteine zum Transport viraler RNAs wurde in einem CAT (Chloracetyltransferase)-Repotersystem gemessen. Um letztendlich den Einfluss der heterologen NESe auf die virale Replikation zu bestimmen, sollten die Rev-(NES)-Proteine in ein das HIV-1-Vollgenom enthaltendes cDNA-Expressionskonstrukt integriert werden. Dazu wurde das in der proviralen cDNA enthaltene Rev Protein durch Mutagenese des NES inaktiviert, und die Rev-(NES) Varianten in das Rev-defiziente Genom an Stelle des akzessorischen nef-Leserahmens eingebracht. Nach Transfektion bzw. Elektroporation der proviralen Plasmide in Säugerzellen erlaubt die Quantifizierung der viralen Partikel somit Rückschlüsse von der NES-vermittelten Exportkinetik auf die biologische Aktivität der Rev-(NES)-Proteine im Kontext pathogener HI-Viren. Die Replikationseffizienz dieser HI-Virusmutanten wurde durch Infektionsversuche bestimmt. Ergebnisse: Vektoren zur Expression von Rev-(NES)-GFP Fusionproteinen in Säugerzellen konnten in dieser Arbeit hergestellt werden. In transienten Expressionstudien konnte die intrazelluläre Verteilung und der Transport der Fusionsproteine in lebenden Säugerzellen mittels Fluoreszenzmikroskopie verfolgt werden. Es zeigte sich, dass HIV-1 Rev-GFP Fusionproteine, welche ein NES mit mittlerer (HIV-1 Rev) und langsamer Exportaktivität (E1b-NES) besitzen, im Nukleus akkumulieren. Ursächlich für diese Akkumulation scheint die 5S-ribosomale RNA zu sein, welche mit der Rev RNA-Bindungsdomäne interagiert und somit die Fusionsproteine im Kern zurückhält. Löst man diese Strukturen durch Behandlung mit Actinomycin D auf, so kommt es zu einer Umlagerung der Fusionsproteine in das Zytoplasma. Interessanterweise weißt das Rev-PKI_NES-GFP Protein, welches ein schnelles NES beinhaltet, a priori eine zytoplasmatische Lokalisation auf, d.h., der nukleäre Export ist schneller als der Kernimport. Ursächlich dafür könnte eine höhere Affinität des PKI-NES zum Exportrezeptor Exportin1/CRM1 sein. Blockiert man hingegen den Kernexport dieses Fusionsproteins durch Behandlung mit dem Export-Inhibitor Leptomycin B, so akkumliert Rev-PKI_NES-GFP wiederum im Nukleus/Nukleolus. Transaktivierungsanalysen im CAT-Reportersystem zeigten, dass Rev-(NES)-GFP Fusionproteine mit einem schnellen NES in der Lage sind, einen schnelleren und effizienteren Rev-abhängigen Kernexport viraler mRNAs zu vermitteln, was sich ebenfalls in der signifikant erhöhten Expression viraler Proteine niederschlug. Das langsame Rev-E1b_NES-GFP Protein war hingegen nicht zur Vermittlung eines Rev-abhängigen mRNA-Transports in der Lage, was sich wiederum zu einer stark erniedrigten viralen Proteinproduktion führte. Ähnliche Ergebnisse wurden auch im Kontext des proviralen HIV-1 Vollgenoms mittels transienter Expressionsanalysen erhalten. Das Replikationsverhalten der unterschiedlichen HIV-1 Virusmutanten konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht studiert werden, da selbst das provirale Expressionskonstrukt, welches das Wildtyp Rev-Protein an Stelle des nef-Leserahmens enthält, keine replikationskompetenten viralen Partikel erzeugte. Schlußfolgerung Die Exportkinetiken von NESen sind in der Lage, die biologische Aktivität von Proteinen zu beeinflussen, wobei eine evolutionäre Feinanpassung von Exportgeschwindigkeit und biologischer Funktion erfolgt zu sein scheint. Der Einsatz spezifischer NESe als „kinetische Werkzeuge“ könnte in gentherapeutischen Anwendung zur Erzeugung eines bestimmten Phänotyps eingesetzt werden. Ebenso scheint es möglich, komplexe Retro- und eventuell auch DNA-Viren durch die kinetische Modifikation essentieller Transportproteine zu attenuieren und diese so für Impfstrategien verwenden zu können.