scFv-basierte Immuntherapeutika als Werkzeuge in der Krebsbehandlung
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One promising approach to treat tumors is immunotherapy, which promotes the elimination of the tumor by manipulation and/or activation of the immune system or by usage of in vitro-generated modified immune components. In this dissertation, two scFv-based strategies for cancer immunotherapy were established and analyzed. In order to improve the clinical success of cancer immunotherapy using dendritic cell (DC)-based vaccines, the loading of monocyte-derived DC with the tumor antigen MAGE-A3 as a model antigen was optimized in sub-project 1 of this dissertation. To this end, the targeting of the DEC-205 endocytosis receptor, which is expressed on DC, with scFv-antigen-constructs was established as a new antigen-loading strategy of DC. In order to analyze whether efficient MHC-class-II-presentation can be achieved by DEC-205-targeting, the anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-construct, which consisted of a DEC-205-directed scFv and an HLA-DP4-restricted MAGE-A3 peptide, was constructed. This fusion protein specifically bound to DEC-205 without causing any negative effects on DC phenotype and functionality. The DEC-205-targeting of DC was superior to RNA electroporation or direct peptide loading in eliciting antigen presentation, and, more importantly, could also be applied to load malignant melanoma patient-derived DC. The presentation of the MAGE-A3 peptide was quantified using T cell receptor (TCR)-RNA-electroporated T cells. In order to simplify the cloning of additional TCR, which can be used to investigate the presentation of further tumorantigens, a PCR-based strategy for the identification and cloning of unknown TCR from T cell clones, as well as a fast and cost-effective assay to functionally characterize newly cloned TCR, were developed. Another strategy to treat cancer is the adoptive transfer of T cells equipped with a chimeric TCR (cTCR). Such cTCR consist of a scFv that mediates the specific binding to the tumor cells and intracellular signaling domains that activate the T cells, resulting in the elimination of the cancer cells. To date, cTCR were most commonly transferred into T cells by retroviral transduction. As retroviral transduction can induce irreversible genetic alterations in the T cell, and the use of such T cells can bear risks such as induction of long-lasting autoimmunity, transiently functional ErbB2- and CEA-specific T cells were generated by transfer of cTCR-encoding RNA in sub-project 2 of this dissertation. These T cells secreted cytokines upon antigen-specific stimulation and lysed antigen-positive tumor cells, although their activity was only half as good as that of the T cells, which were retrovirally transduced with the same cTCR. In conclusion, this dissertation describes two novel strategies how scFv-based immune therapeutics can be used as tools to treat cancer.
Abstract
Eine viel versprechende Strategie zur Behandlung von Tumoren stellt die Immuntherapie dar, bei der ein Tumor durch Manipulation und/oder Aktivierung des Immunsystems oder durch in vitro hergestellte, modifizierte Immunkomponenten eliminiert werden soll. Im Rahmen dieser Dissertation wurden zwei scFv-basierte Ansätze zur Immuntherapie etabliert und analysiert. Um die klinischen Erfolge in der Immuntherapie maligner Erkrankungen mit auf Dendritischen Zellen (DC)-basierten Impfstoffen zu verbessern, wurde im Teilprojekt 1 dieser Arbeit die Beladung von aus Monozyten generierten DC mit dem Tumorantigen (TA) MAGE-A3 als Modellantigen optimiert. Dazu wurde eine neue DC-Antigenbeladungsstrategie, das Targeting des auf DC exprimierten Endozytoserezeptors DEC-205 mit scFv-Antigen-Konstrukten, etabliert. Zur Überprüfung, ob durch DEC-205-Targeting eine effiziente MHC-Klasse-II-Präsentation erzielt werden kann, wurde das anti-DEC-205scFv-MAGE-A3-KKL-Konstrukt, welches einen gegen DEC-205 gerichteten scFv und ein auf HLA-DP4-Molekülen präsentiertes Peptid enthielt, hergestellt. Dieses Fusionsprotein band spezifisch an DEC-205, ohne negative Effekte auf Phänotyp und Funktion der DC auszuüben. Dabei resultierte das DEC-205-Targeting in einer effizienteren Präsentation des Antigens als die Elektroporation mit RNA oder die direkte Beladung mit Peptid und konnte auch zur Beladung von DC, die aus dem Blut von Patienten mit Malignen Melanom generiert wurden, angewendet werden. Die Präsentation des MAGE-A3-Peptids wurde mit T-Zell-Rezeptor (TZR)-RNA-elektroporierten T-Zellen nachgewiesen. Um die Klonierung weiterer TZR zu vereinfachen, die zum Nachweis der Präsentation anderer Antigene eingesetzt werden könnten, wurde eine PCR-basierte Strategie zur Identifizierung und Klonierung unbekannter TZR aus T-Zell-Klonen, sowie ein preiswerter und schnell durchführbarer Test zur funktionellen Charakterisierung neu klonierter TZR etabliert. Eine weitere Option zur Behandlung maligner Erkrankungen ist der adaptive Transfer von T-Zellen, welche zuvor mit einem chimären TZR (cTZR) ausgestattet wurden. Dabei vermittelt ein im cTZR enthaltener scFv die spezifische Bindung an die Tumorzellen und intrazelluläre Signaldomänen des cTZR aktivieren die T-Zelle und ermöglichen so die Beseitigung der Krebszellen. Der Transfer dieser cTZR erfolgte bisher hauptsächlich durch retrovirale Transduktion. Da jedoch die retrovirale Transduktion irreversible genetische Veränderungen in der T-Zelle induzieren kann, und der Einsatz solcher T-Zellen Risiken wie eine langlebige Autoimmunität beinhaltet, wurden im Rahmen des Teilprojekts 2 der Arbeit transient funktionelle ErbB2- und CEA-spezifische T-Zellen durch den Transfer cTZR-kodierender RNA hergestellt. Die cTZR-transfizierten T-Zellen produzierten nach antigenspezifischer Stimulation Zytokine und lysierten antigenpositive Tumorzellen, jedoch war die Aktivität der cTZR-RNA-elektroporierten T-Zellen im Vergleich zu T-Zellen, welche durch retrovirale Transduktion mit demselben cTZR ausgestattet wurden, etwa um die Hälfte reduziert. Zusammenfassend beschreibt diese Dissertation zwei neuartige Strategien, wie scFv-basierte Immuntherapeutika als Werkzeuge in der Krebsbehandlung eingesetzt werden können.