Molekulare Grundlagen der Stereoselektivität Lipase-katalysierter Umsetzungen

Abstract

Die Lipase aus Pseudomonas cepacia ist ein ausgezeichnetes Enzym in der kinetischen Racemattrennung sekundärer Alkohole. Die Stereopräferenz beruht ausschließlich auf der Substratstruktur der Enantiomere, während die Stereoselektivität auf atomaren Wechselwirkungen zwischen Substrat und Lipase beruht. 30 sekundäre Alkohole mit veröffentlichten E-Werten wurden gewählt. Modelle der Ester wurden kovalent in die Bindestelle der Lipase gebunden. Die beiden Enantiomere von 27 Substraten bevorzugten eine von zwei Bindungsmodi: das schnell-umgesetzte Enantiomer in einem produktiven, das langsam-umgesetzte Enantiomer in einem nicht-produktiven Bindungsmodus. Der produktive Bindungsmodus langsam-umgesetzter Enantiomere wird durch abstoßende Wechselwirkungen mit einer starren Wand nahe der Oxyanionen-Bindetasche gestört. Als Folge drückt das Substrat das aktive Histidin aus einer katalytisch effektiven Orientierung und der Abstand d(HNe-Oalc) zwischen Histidin und dem Alkohol-Sauerstoffatom nimmt zu. d(HNe-Oalc) korreliert mit experimentell ermittelten E-Werten: Substrate, die mit der Lipase aus P. cepacia mit hohen E-Werten umgesetzt werden (E > 100), weisen einen Abstand d(HNe-Oalc) > 2.2 &#197; auf und eine effektive Katalyse des Enantiomers wird unterbunden. Substrate mit niederer Selektivität (E < 20) weisen einen Abstand d(HNe-Oalc) < 2.0 &#197; auf. In diesem Fall werden beide Enantiomere mit ähnlichen Reaktionsraten umgesetzt. Eine vergleichbare Abhängigkeit des Abstands d(HNe-Oalc) und experimentell bestimmten E-Werten wurde für chirale Amine festgestellt. Der Abstand d(HNe-Oalc) ist auch ein entscheidender Parameter in Umsetzungen chiraler, sekundärer Alkohole mit zwei benachbarten Stereozentren mit der Lipase aus Candida rugosa. Die in silico Einführung von Punktmutationen in die Bindestelle der Lipase aus P. cepacia führte z.B. für die Einfachmutante Y29L zu einem verlängerten Abstand d(HNe-Oalc). Die erwartete Steigerung des E-Wertes konnte experimentell bestätigt werden.

The lipase from Pseudomonas cepacia represents an excellent catalyst for a highly enantioselective resolution of chiral secondary alcohols. While stereopreference is determined predominantly by the substrate structure of enantiomers, stereoselectivity depends on atomic details of interactions between substrate and lipase. 30 secondary alcohols with published E values using P. cepacia lipase in hydrolysis or esterification reactions were selected. Models of their octanoic acid esters were docked to the open conformation of the lipase. The two enantiomers of 27 substrates bound preferentially in either of two modes: the fast-reacting enantiomer in a productive mode, the slow-reacting enantiomer in a non-productive mode. Productive binding of slow-reacting enantiomers was prohibited by repulsive interaction with a rigid stop near the oxyanion hole. As a consequence, the substrate pushes the active site histidine away from its proper orientation, and the distance d(HNe-Oalc) between histidine side chain and the alcohol oxygen increases. d(HNe-Oalc) was correlated to experimentally observed enantioselectivity: in substrates for which P. cepacia lipase has high selectivity (E > 100), d(HNe-Oalc) is larger than 2.2 &#197; for the slow-reacting enantiomer, thus preventing efficient catalysis of the enantiomer. In substrates of low selectivity (E < 20), however, d(HNe-Oalc) is smaller than 2.0 &#197;. Thus, slow and fast reacting enantiomers are catalysed at similar rates. The same dependence of the distance d(HNe-Oalc) and enantioselectivity was found for investigated chiral amines. The distance d(HNe-Oalc) proved to be also a crucial parameter in Candida rugosa lipase catalyzed conversion of secondary alcohols containing two stereo centers. In silico introduction of point mutations in the binding site of the lipase from Pseudomonas cepacia, which led to an increased distance d(HNe-Oalc), e.g. single mutant Y29L, also resulted in experimentally increased enantioselectivity.