Die Ubiquitin-Proteasom vermittelte Regulation gluconeogenetischer Enzyme in Hefe: die Funktion der RING Untereinheiten der Gid-Ubiquitin Ligase

Abstract

In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass neun sogenannte GID (glucose induced degradation deficient) Gene für den reibungslosen Ablauf der Katabolit-induzierten proteasomalen Degradation von Fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase) essentiell sind. Weiterführende Untersuchungen zeigten, dass sieben der Gid-Proteine (Gid1, Gid2, Gid4, Gid5, Gid7, Gid8 und Gid9) in einem Proteinkomplex vorliegen (Regelmann et al., 2003; Santt et al., 2008). Gid3/Ubc8 ist in diesem Prozess das Ubiquitin-konjugierende Enzym (E2) (Regelmann et al., 2003; Santt et al., 2008). Gid6 ist identisch mit Ubp14, einem deubiquitinierenden Enzym (Pickart, 1997). Gid4 dient als "molekularer Schalter" des Abbauprozesses von FBPase, da es in weniger als fünf Minuten nach Glucosegabe zu gluconeogenetisch gewachsenen Zellen exprimiert wird und die Ubiquitinierungsreaktion von FBPase einleitet (Santt et al., 2008). Mittels bioinformatischer Sequenzanalyse konnte gezeigt werden, dass Gid2/Rmd5 und Gid9/Fyv10 Domänen mit einer hohen Ähnlichkeit zu bekannten RING-Finger-Proteinen besitzen. Durch die Mutation hochkonservierter Aminosäuren in diesen Proteinbereichen konnte der FBPase-Abbau nach Glucosegabe zu gluconeogenetisch gewachsen Zellen beinahe vollständig unterbunden werden. Gid2 ist in der Lage, Proteine in vivo und in vitro zu polyubiquitinieren. Gid2 ist damit maßgeblich für die E3 Ubiquitin-Ligaseaktivität des Gid-Komplexes verantwortlich. In Gid9 führt die Mutation der degenerierten RING-Domäne in vivo zu einem vollständigen Ausbleiben der Ubiquitinierungsreaktion von FBPase, Phosphoenolpyruvatkarboxykinase (PEPCK) und cytoplasmatischer Malatdehydrogenase (c-MDH) und verhindert so deren weiteren proteasomalen Abbau. Gid2 und Gid9 interagieren miteinander und bilden ein für RING-Finger-Proteine typisches Heterodimer aus. Diese Interaktion wird durch die Mutation/Deletion der konservierten LisH-/CTLH-Proteindomänen nur unwesentlich beeinflusst. Das Gid2/Gid9 Heterodimer bindet unabhängig von weiteren Gid-Untereinheiten an Gid1, das "Gerüst"-Protein des Gid-Komplexes. Mittels Gelfiltrationschromatographie war es möglich, die Größe des Gid-Komplexes erstmals genauer zu bestimmen. Der Gid-Komplex fraktioniert zwischen dem Fettsäuresynthasekomplex und dem Aminopeptidasekomplex 1 bei etwa 1000 kDa. Eine Interaktion zu seinen Substratproteinen konnte auf diese Weise nicht nachgewiesen werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Deletion von TOR1 in Saccharomyces cerevisiae zum Absterben der Zellen bei Wachstum auf nicht-fermentierbaren Kohlenstoffquellen führt. Tor1 ist eine essentielle Komponente des TOR-Signalnetzwerkes, durch das zahlreiche Zellfunktionen wie Wachstum und Metabolismus gesteuert werden.

In recent studies nine so-called GID genes (glucose induced degradation deficient) were discovered to be necessary for glucose induced degradation of FBPase via the proteasome. Seven Gid proteins (Gid1, Gid2, Gid4, Gid5, Gid7, Gid8 and Gid9) were shown to be part of a multisubunit protein complex (Ho et al., 2002; Regelmann et al., 2003; Santt et al., 2008). The major ubiquitin conjugating enzym (E2) in this process is Gid3/Ubc8 (Regelmann et al., 2003; Santt et al., 2008). Gid6/Ubp14 is a deubiquitinating enzym (Pickart, 1997). Gid4/Vid24 occurs early after glucose addition to gluconeogenic grown cells. It functions as a molecular switch triggering FBPase polyubiquitylation and subsequent proteasomal degradation (Santt et al., 2008). By sequence analysis a degenerated RING finger domain was discovered in Gid2/Rmd5 and in Gid9/Fyv10. This prompted us to suspect that the Gid complex may be an E3 ubiquitin ligase. In yeast strains carrying mutated GID2*RING or GID9*RING genes, FBPase degradation is actually dramatically impaired after glucose addition to gluconeogenic cells. Gid2 was shown to polyubiquitylate proteins in vivo and in vitro. Gid2 bears E3 ligase activity and is for this reason a crucial catalytic subunit of the Gid ubiquitin ligase complex. Mutation of the degenerated RING finger domain in Gid9 leads to a lack in polyubiquitylation of the gluconeogenic enzymes FBPase, phosphoenolpyruvat carboxykinase (PEPCK) and cytoplasmic malate dehydrogenase (c-MDH) when cells are shifted from gluconeogenic to glycolytic conditions, by this preventing subsequent proteasomal degradation. Gid2 and Gid9 form a heterodimeric subunit and interact in the Gid complex. Deletion of the LisH-/CTLH-domain within Gid2 does not affect the formation of the heterodimer with Gid9. The Gid2/Gid9 dimer binds to Gid1, the scaffold protein of the Gid complex, in the absence of all other Gid proteins. By gel filtration chromatography the size of the Gid complex was determined more exactly. The Gid complex fractionates between the fatty acid synthase complex (ca. 2 MDa) and the aminopeptidase 1 complex (600 kDa) at 1000 kDa. In this way no interaction to its substrates FBPase and PEPCK could be displayed. In this study it is displayed that deletion of TOR1 in Saccharomyces cerevisiae leads to apoptosis under gluconeogenic growth conditions. The Tor1 protein is essential for the TOR signaling network, regulating growth and metabolism in all eukaryotic cells.