To investigate the visual system of the zebrafish, different techniques were used to express genetically-encoded Ca2+ indicators and test their functionality in vivo. XFPs, G-CaMP 1.6 and troponeons were expressed in a mosaic pattern and in single neurons under different promoters in the whole central nervous system of larval zebrafish. Light-evoked responses to a flickering LED in G-CaMP1.6 expressing tectal neurons were recorded with single photon excitation. Furthermore, changes of intracellular [Ca2+] were measured in separate dendritic structures. For the characterization of expression patterns, repeated two-photon imaging of the whole tectum opticum was performed, allowing the monitoring of single cells in high resolution over time.
The analysis of the expression of green fluorescent protein (GFP) showed that nearly all cell types present in the adult, are found as early as 7 dpf (days post fertilisation) in the zebrafish larvae, which was unknown previously. Equally, at 7dpf, the lamination of the tectum opticum was found to be similar to that of the adult. Furthermore, the onset of development of the tectal laminar structure seems to coincidence with the first arborization of retinal axons onto their tectal target (84 hpf).
Linking of these morphological aspects, with functional properties of tectal neurons in the larva, gives valuable information about different players in the visual processing in the tectum. The system developed in the course of this study presents an experimental tool for the investigation of the cytoarchitecture of neural circuits with a quasi non-invasive monitoring of network activity throughout early development in an in vivo preparation, which has direct application to complex questions of systems level neuroscience.

Anwendung von G-CaMP1.6 zur Beobachtung visuell hervorgerufener synaptischer Aktivität in tektalen Neuronen in vivo

Um das visuelle System von Zebrafischen zu untersuchen, wurden verschiedene Methoden eingesetzt zur genetischen Exprimierung von Ca2+ Indikatoren und ihrer Anwendung in vivo. XFPs, G-CaMP 1.6 und Tropeonen wurden sowohl in Mosaik-Mustern als auch in einzelnen Neuronen exprimiert vermittels verschiedener Promoteren im gesamten Zentralnervensystem von Zebrafischlarven. Die Reizantworten tektaler, G-CaMP 1.6 exprimierender Neuronen auf Lichtanregung wurde durch Einzel-Photonen-Exzitation erfasst. Weiterhin wurden Veränderungen intrazellulären [Ca2+] in unterschiedlichen dendritischen Strukturen gemessen. Für die Bestimmung von Expressionsmustern wurde wiederholt das gesamte tectum opticum mittels Zwei-Photonen-Lasermikroskopie erfasst, was eine Zeitreihenanalyse einzelner Zelltypen ermöglichte.
Die Untersuchung der Exprimierung von GFP (grün fluoreszierendes Protein) zeigte, dass fast alle Zelltypen des erwachsenen Zebrafisches bereits sehr früh, um 7 dpf (Tage nach Befruchtung) in der Zebrafischlarve vorhanden sind, was bis jetzt nicht bekannt war. Es wurde festgestellt, dass bereits zur selben Zeit (7 dpf) auch der Schichtaufbau des tecti dem des erwachsenen Zebrafisches sehr ähnlich ist. Dabei scheint die Einleitung der Entwicklung des tektalen Schichtaufbaus mit dem ersten Verzweigungen der retinalen Axonen zu ihren tektalen Zielzellen zeitlich zusammenzufallen (84 hpf, Stunden nach Befruchtung).
Diese Beobachtungen morphologischer Art liefern zusammen mit dem Wissen über die funktionellen Eigenschaften tektaler Neuronen in der Zebrafischlarve wertvolle Informationen über die an der Verarbeitung von visueller Information im tectum beteiligten Komponenten. Weiterhin stellt das während der für diese Arbeit entwickelte System ein wertvolles experimentelles Hilfsmittel dar für die Untersuchung des zellulären Aufbaus neuronaler Netzwerke durch die Beobachtung der Netzwerkaktivität auf quasi nicht-invasive Weise in einer in vivo-Präparation; dies ist direkt verwendbar für die Untersuchung komplexer Fragestellungen auf höherer Ebene in der systematischen Neurowissenschaft.