Electrophysiological characterization and interplay of TRPC1 channels and voltage-gated Ca2+ channels

Abstract

In many non-excitable cells, which do not generate action potentials by themselves, extracellular chemical signals, like hormones and neurotransmitters, are transduced into membrane depolarizations, which in turn activate voltage-gated Ca2+ (CaV) channels. Hormones and their GPCRs activate transient receptor potential TRPC channels, which allow Na+ and Ca2+ influx, initiating Ca2+-dependent signalling pathways and, in addition, depolarize the plasma membrane and thereby activate CaV channels. To be able to investigate the interplay of TRPC and CaV channels the present study focused on the electrophysiological characterization of L- and T-type CaVs, their β subunits and TRPC ion channels, especially TRPC1, TRPC4, TRPC5, TRPC4/TRPC1 and TRPC5/TRPC1. Expression of TRPC1 wild-type or TRPC1 with mutations at the putative lower gate in HEK-cells did not reveal any detectable current. However, TRPC1 coexpressed with TRPC4 reveals functional heteromeric TRPC4/TRPC1 channels with altered biophysical properties as compared to monomeric TRPC4. While most of the TRPC1 mutations had no effect, TRPC1 V741A significantly increased TRPC4/TRPC1 currents. In addition, chimeras of TRPC4 backbone with TRPC1 pore revealed constitutive activity, sensitive to the TRPC blocker SKF 96365. The results suggest that TRPC1 contributes to the pore in TRPC4/TRPC1 heteromers and can form a permeable constitutive active channel pore itself. A subset of pituitary cells functionally expresses heteromeric TRPC5/TRPC1 channels. Pituitary cells isolated from TRPC1-deficient mice revealed homomeric TRPC5 currents with altered current-voltage relationship, lower amplitudes and higher Ca2+ permeability as compared to TRPC5/TRPC1 heteromeric channels in wild-type. Thus, TRPC1 modulates activity and Ca2+ permeability of TRPC5 in vivo and thereby the Ca2+ influx in pituitary cells. Auxiliary subunits, the CaVβ proteins, are required for the function of CaV channels. To study the impact of CaVβ subunits on the function of L- and T-type CaV channels, different β subunits were coexpressed with the CaVs in HEK-cells. CaVβ2 splice variants increased the L-type CaV1.2 current, but did not significantly affect T-type CaV3.2 currents, whereas CaVβ3 significantly inhibit CaV3.2 currents. In addition, CaVβ3 serves Ca2+ channel independent functions in fibroblasts, where I could not detect CaV currents and where CaVβ3 changes the sensitivity of the inositol trisphosphate (IP3) receptor for low concentrations of IP3. CaV3.2 currents are also inhibited by Englerin A (EA; EC50 222 nM), which had so far assumed to be a specific agonist of TRPC4, TRPC5, TRPC4/TRPC1 and TRPC5/TRPC1 channels. An electrophysiological characterization of a CaV3.2 mutant, identified in a Spanish family and linked to hyper-aldosteronism and hypertension is ongoing.

In vielen nicht erregbaren Zellen, die selbst keine Aktionspotentiale erzeugen, werden extrazelluläre chemische Signale wie beispielsweise Hormone und Neurotransmitter in Membrandepolarisationen umgewandelt, die wiederum spannungsabhängige Calcium Kanäle aktivieren. Die Hormone beziehungsweise die durch sie stimulierten GPCRs können transiente Rezeptorpotential TRPC Kanäle aktivieren, was einen Na+- und Ca2+-Einstrom ermöglicht. Der Ca2+-Einstrom initiiert Ca2+-abhängige Signalwege, und der Na+-Einstrom führt zur Depolarisation der Plasmamembran wodurch spannungsgesteuerte Ca2+ (CaV) Kanäle aktiviert werden. Um das Zusammenspiel von TRPC und CaV Kanälen untersuchen zu können, konzentrierte sich die vorliegende Studie auf die elektrophysiologische Charakterisierung von CaVs vom L- und T-Typ, ihren β-Untereinheiten und von TRPC Ionenkanälen, insbesondere TRPC1, TRPC4, TRPC5, TRPC4/TRPC1 und TRPC5/TRPC1. Die Expression von TRPC1 Wildtyp oder TRPC1 mit Mutationen am mutmaßlichen unteren Gate ergab in HEK-Zellen keinen nachweisbaren Strom. Mit TRPC4 coexprimiert führt TRPC1 jedoch zu funktionellen heteromeren TRPC4/TRPC1 Kanälen, die veränderte biophysikalische Eigenschaften im Vergleich zu monomerem TRPC4 aufweisen. Während die meisten TRPC1 Mutationen keine Wirkung auf TRPC4/TRPC1 Ströme hatten, erhöhte TRPC1 V741A die TRPC4/TRPC1 Ströme signifikant. Zusätzlich zeigten Chimären des TRPC4-Rückgrats mit TRPC1-Poren eine konstitutive Aktivität, die mit dem TRPC-Blocker SKF 96365 inhibiert werden konnte. Die Ergebnisse legen nahe, dass TRPC1 zur Pore in TRPC4/TRPC1-heteromeren Kanälen beiträgt und selbst eine Ionenpermeable konstitutiv aktive Kanalpore bilden kann. Ein Teil von Hypophysenzellen exprimiert funktionell heteromere TRPC5/TRPC1 Kanäle. Aus TRPC1-defizienten Mäusen isolierte Hypophysenzellen zeigten homomere TRPC5 Ströme mit veränderter Strom-Spannungs-Beziehung, niedrigeren Amplituden und höherer Ca2+-Permeabilität im Vergleich zu heteromeren TRPC5/TRPC1 Kanälen in Wildtyp Hypophysenzellen. Somit moduliert TRPC1 die Aktivität und Ca2+-Permeabilität von TRPC5 in vivo und damit den Ca2+-Einstrom in die Hypophysenzellen. Die CaVβ-Proteine werden für die Funktion von CaV Kanälen benötigt. Um den Einfluss von CaVβ-Untereinheiten auf die Funktion von CaV Kanälen vom L- und T-Typ zu untersuchen, wurden verschiedene β-Untereinheiten mit den CaVs in HEK-Zellen coexprimiert. CaVβ2-Spleißvarianten erhöhten den CaV1.2 Strom vom L-Typ, beeinflussten jedoch die CaV3.2 Ströme vom T-Typ nicht signifikant, während CaVβ3 die CaV3.2 Ströme signifikant inhibierte. Darüber hinaus erfüllt CaVβ3 CaV-unabhängige Funktionen in Fibroblasten, bei denen ich keinen CaV Strom nachweisen Zusammenfassung XXV konnte und bei denen CaVβ3 die Empfindlichkeit des Inositoltrisphosphat (IP3) Rezeptors für niedrige IP3-Konzentrationen verändert. CaV3.2 Ströme werden auch durch Englerin A (EA, EC50 222 nM) gehemmt. Für EA wurde bisher angenommen, dass es ein spezifischer Agonist von TRPC4, TRPC5, TRPC4/TRPC1 und TRPC5/TRPC1 Kanälen ist. Die elektrophysiologische Charakterisierung einer CaV3.2 Mutante, die in einer spanischen Familie identifiziert und mit Hyperaldosteronismus und Hypertonie in Verbindung gebracht wurde, ist noch nicht abgeschlossen. Der Anhang enthält zusätzliche Experimente zu den im Ergebnissteil beschriebenen Daten.