Characterization and optimization of 1-hexanol production in CO-utilizing clostridia

Kottenhahn, Patrick; Büchs, Jochen; Blank, Lars M.

doi:41717

Characterization and optimization of 1-hexanol production in CO-utilizing clostridia

Kottenhahn, Patrick^RWTH*

2022

Verantwortlichkeitsangabevorgelegt von Patrick Kottenhahn M. Sc. Molekulare Biowissenschaften

ImpressumAachen : RWTH Aachen University 2022

Umfang1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme

Dissertation, RWTH Aachen University, 2022

Veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Büchs, Jochen (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2022-09-20

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2022-09961
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/855064/files/855064.pdf

Einrichtungen

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
acetogenic bacteria (frei) ; alcohols (frei) ; biofuels (frei) ; circular economy (frei) ; clostridium (frei) ; syngas fermentation (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Ziel dieser Arbeit ist die Optimierung von Hexanolproduktion aus Syngas. Hexanol kann z.B. zu Kunst-,Treib- oder Zusatzstoffen verarbeitet werden. Zwei potenzielle Biokatalsyatoren, C. carboxidivorans und C. ljungdahlii wurden charakterisiert und für diese Anwendung bewertet. Im Folgenden sind die wichtigsten Ergebnisse zusammengefasst: Die Betrachtung der Bioenergetik des Stoffwechselweges zeigten die Möglichkeit von Hexanolproduktion ohne Nebenprodukte. Die Toxizitätvon Hexanol wurde als ein limitierender Faktor identifiziert und konnte durch Extraktion umgangen werden. Dies steigerte die Produktion um den Faktor ~2.5 auf 24 mM Hexanol. Beide Bakterienarten zeigten ähnliche Hexanoltoleranz mit akuter Inhibierung bei ≤ 20 mM. Bei 30°C war die Hexanoltoleranz von C. carboxidivorans (IC50 17.5 mM) höher als bei 37°C (IC50 11.8 mM). Für die Maßstabsvergrößerung von Flaschen zum Rührkesselreaktor wurden die Gasbereitstellung, gemessen als relative gelöst-CO Konzentration, und unterschiedliche Nährstoffanforderungen als wichtigste Faktoren erkannt. Der höchste hierbei produzierte Hexanoltiter von 37 mM ist ca. dreimal so hoch wie die höchste in anderen Studien berichtete Ausbeute. Um die heterologe Hexanolproduktion mit C. ljungdahlii zu optimieren, wurden alternative Hexanolproduktionsenzyme in transgenen C. ljungdahlii Stämmen verglichen. Die erreichten Ausbeuten blieben jedoch unter denen von C. carboxidivorans. Nur nach Hitzeschock des Empfängers oder durch Expression der Methyltransferasen von C. carboxidivorans im Donorstamm wurden in Konjugationsversuchen mit C. carboxidivorans Kolonien erhalten. Diese wuchsen in Gegenwart der zur Selektion gewählten Antibiotika, verifizierbare Flüssigkulturen wurden jedoch nichterhalten. Das Methylierungsmuster von C. carboxidivorans wurde untersucht und die identifizierten Motive wurden den jeweiligen Enzymen zugeordnet. Konvertergas (KG) wurde mit synthetischem KG verglichen, um die Wirkung inhibierender Komponenten zu ermitteln. Ohne Verdünnung des Gases wurde bei niedrigen Zelldichten kein Wachstum beobachtet. Dies konnte mit hohen Zelldichtenteilweise umgangen werden. Finale Produkt- und Wachstumsausbeuten waren jedoch bei beiden Gasen vergleichbar. Wurde die Gasphase erneuert, stoppte das Wachstum auch bei hohen Zelldichten, eine Adaptation auf das Gas wurde nicht beobachtet. Im Vergleich zu synthetischem KG waren Wachstums-und Produktausbeuten mit H2+CO2 reduziert. Niedriger pH und die Zugabe von 2 g L-1 Carbonat zum Medium führten zu höheren Hexanoltitern. C. carboxidivorans stellt somit einen vielversprechenden Ausgangsstamm für die Hexanolproduktionaus Syngas dar. Die in dieser Studie erreichten Titer von 37 mM (3.8 g L-1) Hexanol sind höher als alle bisher publizierten Werte mit biologischen Alternativen. Aktuell fehlt für C. carboxidivorans jedoch eingenetisches System. Wenn die in dieser Arbeit identifizierten Fragestellungen adressiert werden, kann die Hexanolproduktion aus Syngas potenziell zu einem kommerziell erfolgreichen Prozess entwickeltwerden, um Kohlenstoffemissionen zu senken und die gesellschaftliche Abhängigkeit von fossilen Kohlenstoffquellen zu reduzieren.

The goal of this thesis is the optimization of hexanol production from syngas. Hexanol can be used i.e.for the production of plastics, fuels and additives. Two potential biocatalysts, C. carboxidivorans and C. ljungdahlii, were characterized and evaluated for this application.These are the most important results obtained in this study: Bioenergetic calculations revealed that hexanol could be produced as the sole fermentation product from syngas. Hexanol toxicity was identified as a crucial limiting factor in hexanol production and could be circumvented by product extraction, increasing yields ~2.5 fold to 24 mM hexanol. The overall toxicity of hexanol towards both tested species was similar with acute inhibition at ≤ 20 mM. The hexanol tolerance of C. carboxidivorans was higher at 30°C (IC50 17.5 mM) than at 37°C (IC50 11.8 mM) and extraction led to detoxification only at the lower temperature. During scale-up from bottles to CSTR, gas delivery, measured as dissolved CO tension, and different nutrient requirements were identified as important bottlenecks. The highest hexanol titer produced in the CSTR was 37 mM. This is ~3 times the currently highest titer reported in other studies. To improve heterologous hexanol production with C.ljungdahlii, different enzymes were analyzed in transgenic C. ljungdahlii strains but the produced hexanol titers still remained lower than the titers obtained with C. carboxidivorans. In conjugation experiments with C. carboxidivorans, colonies could only be obtained either after heat shock of the recipient or after use of a donor strain expressing the C. carboxidivorans methyl transferases. These colonies displayed resistance towards the selection markers, but no verifiable liquid cultures could beobtained. The methylation pattern of C. carboxidivorans was investigated and the discovered motifs were attributed to respective methyl transferases. Converter gas (CG) was compared to synthetic CG with the same composition to investigate toxic effects of minor gas components. Without dilution of the gas and low cell densities, no growth was observed. High cell densities could partially circumvent inhibition and final product- and growth yields were similar with real and synthetic CG. If the gas phase was renewed, growth ceased even at high cell densities. No adaptation towards CG was observed. Compared to synthetic CG, hexanol production and growth yields were reduced with only H2+CO2 as substrate. Screening of different media compositions revealed improvement through addition of 2 g L-1 carbonate and a lower pH. In conclusion, C. carboxidivorans is a promising candidate for hexanol production from syngas. The hexanol titers obtained in this study of 37 mM (3.8 g L-1) is higher than titers reported for transgenic biocatalysts as well as co-cultivations. The major drawback is the lack of reliable methods for genetic manipulation. By addressing the crucial points identified in this work, hexanol production from syngas could be developed into a commercial process that can decrease net carbon emissions while simultaneously reducing dependence on fossil carbon sources. This is a step towards a greener andmore sustainable economy.

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