Development of synthetic biology tools for Pseudomonas putida

Köbbing, Sebastian; Wierckx, Nick; Blank, Lars M.

doi:10.18154/RWTH-2020-09053

Development of synthetic biology tools for Pseudomonas putida = Entwicklung von Werkzeugen der synthetischen Biologie für Pseudomonas putida

Köbbing, Sebastian^RWTH*

2020

VerantwortlichkeitsangabeSebastian Köbbing

Ausgabe1. Auflage

ImpressumAachen : Apprimus Verlag 2020

Umfang1 Online-Ressource (XVI, 162 Seiten) : Illustrationen, Diagramme

ISBN978-3-86359-899-0

ReiheApplied microbiology ; 23

Dissertation, RWTH Aachen University, 2020

Auch veröffentlicht auf dem Publikationsserver der RWTH Aachen University

Genehmigende Fakultät
Fak01

Hauptberichter/Gutachter
Blank, Lars M. (Thesis advisor)^RWTH* ; Wierckx, Nick (Thesis advisor)^RWTH*

Tag der mündlichen Prüfung/Habilitation
2020-08-25

Online
DOI: 10.18154/RWTH-2020-09053
URL: https://publications.rwth-aachen.de/record/801739/files/801739.pdf

Einrichtungen

Projekte

P4SB - P4SB - From Plastic waste to Plastic value using Pseudomonas putida Synthetic Biology (633962) (633962)

Inhaltliche Beschreibung (Schlagwörter)
Pseudomonas putida (frei) ; gene expression (frei) ; genomic integration (frei) ; promoter activity (frei) ; synthetic biology (frei)

Thematische Einordnung (Klassifikation)
DDC: 570

Kurzfassung
Biotechnologische Anwendungen sind eine zukunftsweisende Alternative, um die chemische Produktion von Fein- und Massenchemikalien zu ersetzen. Die zirkulare (Bio)Ökonomie zielt darauf ab, fossile Rohstoffe durch nachwachsende Biomasse, CO2 und Kohlenstoffreiche Abfallprodukte zu ersetzen. Dabei werden Wirtsorganismen mit einem erweiterten Substratspektrum verwendet, um dieselben Produkte in einem biologischen System zu produzieren. Die synthetische Biologie wird genutzt, um maßgeschneiderte Überproduktionsstämme für die Anwendungen zu entwickeln. Ein prominenter Vertreter ist Pseudomonas putida KT2440. Ein vielseitiger Stoffwechsel und eine hohe Resistenz gegenüber oxidativem Stress zeichnen diesen Organismus aus. Das Ziel dieser Arbeit war die Anzahl gut charakterisierter und rational konstruierter genetischer Werkzeuge für P. putida KT2440 zu erweitern. Diese Doktorarbeit leistet einen Beitrag dazu, die Zuverlässigkeit in der synthetischen Biologie zu steigern, welche sich häufig als problematisch erweist. Wir haben mehrere Sigma-70-Faktor-abhängige synthetische Promotoren und Kombinationen für die heterologe Genexpression konstruiert und charakterisiert. Eine Promoter-Bibliothek mit einzelnen Basenaustauschen wurde erzeugt, welche zeigte, dass die -35 und -10 Regionen für eine effiziente Promotoraktivität entscheidend sind. Kombinierte Promotoren erlaubten uns, die resultierende Expressionsstärke vorherzusagen, nachdem der genetische Kontext genau charakterisiert wurde. Eine stabile genomische Integration wird häufig für das metabolische Engineering benötigt, es fehlen jedoch charakterisierte Stellen im Genom von P. putida KT2440. Wir haben RNA-Seq-Daten analysiert, um geeignete Integrationsstellen im Genom von P. putida KT2440 zu identifizieren, die gleichmäßig exprimiert werden. Die Charakterisierung der Integrationsstellen zeigte eine hohe Expressionsstärke mit geringer Variabilität, während die Stämme mit verschiedenen Kohlenstoffquellen kultiviert wurden. Die Verwendung von charakterisierten Promoter Sequenzen und Integrationsstellen erlaubt die Genexpression auf zwei Ebenen zu steuern und abzustimmen. Des Weiteren wurden in dieser Doktorarbeit Werkzeuge für das Recycling von Resistenzgenen entwickelt und ein Promoter der von einem alternativen Sigma-Faktor abhängig ist. Zusammenfassend trägt diese Arbeit zur synthetischen Biologie für P. putida KT2440 bei. Die steigende Zahl an verfügbaren und insbesondere charakterisierten Werkzeugen unterstützt die Anstrengungen, P. putida KT2440 als Modelorganismus sowohl in der Bioökonomie als auch in der biotechnologischen Anwendung zu etablieren. Die Verwendung von aromatischen Verbindungen aus Kunststoffen oder Lignin als Substrat stellt eine große Herausforderung dar. Hier kann P. putida KT2440 Vorteile gegenüber anderen etablierten Mikroorganismen nutzen.

Biotechnological applications become a forward-looking alternative to chemical production of fine and bulk chemicals. The envisaged circular (bio)economy is aiming to replace fossil resources by renewable biomass, CO2, and other carbon-rich streams like plastic. Microbial hosts with an expanded range of substrates are used to produce all required products. Here, synthetic biology is used for the tailoring of hyperproducing strains, starting with the prominent chassis strain Pseudomonas putida. P. putida KT2440 has a versatile metabolism and high resistance towards oxidative stress. Biotechnological applications become a forward-looking alternative to chemical production of fine and bulk chemicals. The envisaged circular (bio)economy is aiming to replace fossil resources by renewable biomass, CO2, and other carbon-rich streams like plastic. Microbial hosts with an expanded range of substrates are used to produce all required products. Here, synthetic biology is used for the tailoring of hyperproducing strains, starting with the prominent chassis strain Pseudomonas putida. P. putida KT2440 has a versatile metabolism and high resistance towards oxidative stress. This thesis aimed to increase the number of rationally designed and well-characterized genetic tools for P. putida KT2440 to foster synthetic biology. This thesis contributes to the reliability of synthetic biology that often proved as a major issue. We constructed and characterized several sigma-70 factor dependent synthetic promoters and combinations for heterologous gene expression. A library was constructed with single nucleotide exchanges, which reveals that the -35 and -10 regions are crucial for efficient promoter activity. Combined promoters, so-called stacked promoters, allowed, after detailed characterization of the genetic context, prediction of the resulting expression strength. Stable genomic integration is often used for metabolic engineering, but characterized sites, so-called landing pads, across the genome of P. putida KT2440 are missing. We analyzed RNA-Seq data towards regions that are equally expressed to identify suitable integration sites across the genome of P. putida KT2440. These landing pads enabled high heterologous expression with low variability. With well-characterized promoters and landing pads, fine tuning of gene expression can be conducted on two levels, promoter and integration site. Additionally, the thesis delivers tools for marker recycling and an alternative sigma dependent promoter. In summary, this thesis contributes to P. putida KT2440 synthetic biology. The increased number of well-characterized tools will further support the many efforts to establish this microbe as a workhorse in the bioeconomy and biotechnological applications. Getting the tough challenges, like the use of aromatic compounds from plastic or lignin as substrates, will distinguish P. putida KT2440 from the well-established microbes.

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